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       【关键词】  枳实；,,总黄酮；,,提取工艺；,,正交实验
       摘要：目的优化枳实总黄酮最佳提取工艺。方法以柚皮苷为对照，用紫外分光光度法在283 nm处测定总黄酮含量，以总黄酮含量为指标，应用正交实验，优选枳实总黄酮最佳提取工艺，并对总黄酮水洗除杂的工艺进行了优化。结果优选出的最佳提取工艺是：60%乙醇，8倍量，回流提取2次，每次1.5 h。水洗除杂工艺为：9倍量水静置24 h，共2次。结论 提取的总黄酮含量达到了70%，工艺简便、可行，生产成本低，可供工业化生产参考。
       关键词：枳实；  总黄酮；  提取工艺；  正交实验
       Optimization of the Extracting Method of Total Flavonoids from Frutus aurantii immaturus
       LIU Wenjuan, GENG Qiuju, CAI Rong, YAO Daolu
       (Hebei Yiling Academy of Medicine, Shijiazhuang, 050035, China)
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction procedure of the total flavonoids from Frutus aurantii immaturus.  MethodsExtraction procedure was screened by orthogonal test according to the content of the total flavonoids which was measured through UV spectrophotometry at 283 nm using naringin as control, and the procedure of removing impurity was screened by water.ResultsThe optimized extraction procedure was as follows: 60% alcohol, 8 times volume of the weight of the dried material, refluxing 1.5 h for 2 times. The procedure of removing impurity in water was as follows: 9 times volume of the weight of the dried material, placed 24 h for 2 times.ConclusionThe content of the total flavonoids is above 70%. The procedure is simple and feasible. The production cost is low. The procedure can provide a reference to the production.
       Key words：Frutus aurantii immaturus；  Total flavonoids；  Extraction procedure；  Orthogonal test
   
　　枳实为常用中药，具有破气消积，化痰散痞的功效。药理毒理研究表明枳实总黄酮提取物对肠平滑肌具有双向调节作用，而且其毒性小，安全范围大，药用价值非常明显，因此，本文对枳实总黄酮的提取、精制工艺进行了研究。
       　　1  仪器与试药
       1.1  仪器电热套981B型（天津市泰斯特仪器有限公司）；紫外分光光度计UV2550。
       1.2  试药柚皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110722200309)；枳实药材购自河北以岭饮片有限公司，经鉴定为芸香科植物酸橙的干燥幼果；化学试剂除提取用医用酒精外，均为分析纯试剂。
       　　2  方法
       根据文献［1］，采用紫外分光光度法测定枳实总黄酮含量。而柚皮苷紫外最大吸收峰与总黄酮相同，分别在283 nm处产生最大吸收，且柚皮苷可自中国药品生物制品检定所购买，因此，使用柚皮苷作为总黄酮测定的对照品。
       2.1  标准曲线的测定精密称取柚皮苷对照品5.28 mg ,置50 ml量瓶中,甲醇定容至刻度,作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.5 ，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml于10 ml量瓶中,甲醇定容至刻度,以甲醇为空白, 在283 nm 处测吸收度。得回归方程为: A =0. 027C - 0.001 , r = 0.999 9。线性范围为5.28～31.68 μg・ml1。
       2.2  供试品溶液制备供试品溶液制备
       2.2.1  枳实药材将枳实药材粉碎成中粉，精密称取200 mg，用甲醇定容于50 ml容量瓶中，超声提取30 min，冷却到室温，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，精密吸取续滤液3 ml置100 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
       2.2.2  正交供试品溶液 将正交工艺所得的干浸膏，分别精密称取约50 mg置25 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声15 min后冷却至室温，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，精密吸取续滤液5 ml置100 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得供试品溶液。
       　　3  枳实总黄酮提取工艺的研究
       3.1  提取工艺的优化研究柚皮苷是枳实总黄酮的主要组成成分，根据其理化性质，我们使用高浓度乙醇对枳实进行提取。为了控制提取质量，我们用紫外分光光度法在283 nm以柚皮苷为对照测定枳实总黄酮的含量，采用正交试验法对其醇提工艺进行优选，获得了最佳条件。
       3.1.1  干浸膏的制备方法 称取枳实药材粗粉100 g，按要求加入乙醇热回流提取。提取液过滤，转入蒸发皿在水浴锅上蒸发浓缩至稠膏，稠膏经70℃真空干燥，粉碎成末，得干浸膏。
       3.1.2  提取溶媒的考察实验 分别用50%， 60%，70%，80%的乙醇8倍量对枳实进行提取，热回流2次，2 h/次。以出膏率和干浸膏中枳实总黄酮含量为综合考察指标，从而确定正交实验乙醇浓度的水平，其中“出膏率=干膏重/生药量×100%” 。结果见表1。
       表1  提取溶媒考察的实验结果（略）
       从表1可知，选用较高浓度的乙醇提取时，黄酮苷含量较高，出膏率低，易于纯化处理。因此，正交实验选择乙醇浓度60%，70%，80%作为考察的三个水平。
       3.1.3  正交实验根据工艺要求，选定乙醇浓度、乙醇量、提取时间、提取次数作为考察的4个因素，各取3个水平，以出膏率和干浸膏中枳实总黄酮量为综合考察指标，选用L9 (34)正交实验表进行实验。因素水平表见表2，实验结果见表3。
       表2  因素水平（略）
       根据上述正交实验结果可知，乙醇浓度、提取次数为影响枳实提取出膏率的主要因素，最佳工艺为A1B3C3D3；提取次数为影响枳实总黄酮含量的主要因素，最佳工艺为A1B3C2D2。综合考虑二者结果，确立枳实总黄酮提取的最佳工艺为A1B3C2D2，即药材加8倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次。
       3.1.4   验证实验 根据正交实验结果，优选工艺与总黄酮的最佳提取工艺相同，因此运用优选工艺进行3批放大的验证实验。结果见表4。根据结果可知，优选工艺可行，与正交实验结果一致。
       3.2  水洗除杂工艺的研究［2］上述醇提工艺确定后，总黄酮的含量仍然比较低。因此，我们根据柚皮苷不易溶于冷水的性质，选用水洗法除去醇提物中的水溶性杂质，提高总黄酮含量。
       3.2.1  方法将枳实醇提取物60 g,按要求加水，充分搅拌后静置。再把水倾出，将沉淀中残余的水分蒸干后，按供试品方法制备，紫外分光光度法检测总黄酮含量。
       3.2.2  结果考察加水量、放置时间、水洗次数对总黄酮含量的影响。结果见表5~7。
       表3   正交实验优选工艺结果（略）
       K，k以出膏率计算，K"、k"以总黄酮量计算
       表4  验证实验结果（略）
       表5  加水量的考察（略）
       由表5可知，9倍量水洗后的枳实提取物总黄酮含量最高，因此选择9倍的水进行水洗。
       表6  放置时间的考察（略）
       由表6可知，放置24 h，总黄酮含量已稳定，因此选择放置时间为24 h。
       表7  水洗次数的考察（略）
       由表7可知，水洗2次时已达到70%，因此选择水洗2次。
       　　4  讨论
       本研究通过正交试验确定了枳实总黄酮最佳提取工艺，即药材加8倍量60%乙醇，回流提取2次，1.5 h/次。水洗除杂工艺为9倍量水洗涤2次，24 h/次。采用上述提取除杂工艺，枳实总黄酮的含量可达到70%。该工艺简便、可行,生产成本低,可供工业化生产参考。本研究结果对开发利用枳实资源有一定的意义。
       　　参考文献：
       ［1］  韦黄杰，舒  斌，陈玉俊，等. 分光光度法测定化橘红总黄酮含量［J］.中成药，2005， 27（3）：354.
       ［2］  杨  去，张  晶，陈玉婷.天然药物化学成分提取分离手册［M］.北京：中国中药出版社，2003：1.
       (河北以岭医药研究院，河北  石家庄  050035)