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       【关键词】  生存素
       摘要：目的探讨肝细胞肝癌（HCC）中生存素（Survivin.）和nm23H1表达的临床意义及两者的相互关系。方法采用免疫组织化学SP法检测40例HCC及26例癌旁肝组织中Survivin 和nm23H1的表达。结果①Survivin、nm23H1在HCC中的阳性表达率分别为57.5%（23/40）、42.5%（17/40），两者阳性表达率明显分别高于、低于癌旁肝组织（P＜0.01）；②Survivin的表达与HCC的分化程度、转移、癌栓有关（P＜0.05）,而与HCC患者的性别、发病年龄、原发肿块大小无关（P＞0.05）；③nm23H1的表达与HCC的转移、癌栓有关（P＜0.05）,而与HCC患者的性别、发病年龄、原发肿块大小及分化程度无关（P＞0.05）；④在HCC中，Survivin与nm23H1间的表达无明显相关性（r=0.125,P＞0.05）。结论 Suvivin和nm23H1可作为反映HCC发生发展及预后判断的重要指标。
       关键词：癌；肝细胞；生存素；nm23H1；免疫组织化学
       Expression of Survivin and Nm23H1 and their Clinical Significance in Hepatocellular Carcinoma
       XIONG Renhai， SUN Quan
       （Department of Surgery,Zhongnan Hospital of Wuhan University,  Wuhan 430071, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the expression and the clinical significance of survivin and nm23H1 and their correlations in hepatocellular carcinoma(HCC).Methods Expressoin of Survivin and nm23H1 in 40 HCC samples and in 26 samples from neighboring regions of correlative HCC were detected by using immunohistochemical SP method. Results①Survivin and nm23H1 expression rate were detected at 57.5%（23/40）and 42.5%（17/40）respectively. The positive expression rate of survivin and nm23H1 in HCC were significantly higher and lower than in their neighboring regions(P＜0.01). ②The expression of survivin in HCC had association with the differentiated level、the metastasis and the cancer embolus (P＜0.05), but no association with the patient sexuality、age、and the tumor size (P＞0.05).③ The expression of nm23H1 in HCC had association with the metastasis and the cancer embolus(P＜0.05),but no association with the patient sexuality、age、the tumor size and the differentiated level (P＞0.05). ④ In the cases of HCC, there was no significant correlation between the expression of survivin and nm23H1.ConclusionExpression of survivin and nm23H1  might be important markers in  reflecting of carcinogenesis、progression and prognosis of HCC.
       Key words：Carcinoma, Hepatocellular; Survivin;  Nm23H1; Immunohistochemistry
                                                                                 　　原发性肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma. HCC）是常见的恶性肿瘤之一，统计学资料表明［1］： HCC已上升为我国恶性肿瘤的第二位，且发病年龄有年轻化趋势，目前以手术为主的综合治疗，术后复发率仍很高，因而HCC的早期诊断与治疗成为当前肿瘤研究的热点课题。近年来研究发现，在细胞凋亡抑制蛋白（IAP）家族中,Survivin参与了细胞凋亡的调控，与肿瘤的发生发展、侵袭转移及复发密切相关。目前已明确nm23H1是人类最明确的肿瘤转移抑制基因之一，nm23H1不但可抑制肿瘤的转移，而且可能参与肿瘤形成过程的调节。本研究采用免疫组化SP法对40例HCC及其癌旁肝组织中Survivin及nm23H1蛋白的表达进行研究,借以探讨两种蛋白在HCC的发生发展、侵袭转移中的作用。
       　　1 材料与方法
       1.1  材料40例HCC病例及相应的26例癌旁非癌肝组织均为武汉大学中南医院病理科1997~2001年间存档的石蜡包块病例，40例病例均为手术切除并经病理诊断为HCC（按中国常见恶性肿瘤诊治规范的组织学标准），且都有完整的临床病理资料,术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗。根据临床病理资料符合下列任一条件的归入转移组①肝门或大网膜淋巴结转移；②肝内转移（主癌灶外周围肝瘤数目≥2个）；③其他脏器存在转移灶。.存在癌栓的病例为①光镜下观察HE染色或免疫组织化学切片，发现小血管内有癌细胞或癌细胞经静脉管壁进入血管；或②门静脉内有癌栓。所有标本均径10%中性福马林溶液固定，常规取材，石蜡色埋，4μm连续切片3张，1张作HE染色，观察病理组织学特征，另2张分别作Survivin及nm23H1的免疫组化染色。
       1.2  方法
       采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶法（SP法），主要试剂：兔抗人Survivin多克隆抗体（即用型）及SP超敏试剂盒购自福州迈新公司；鼠抗人nm23H1，单克隆抗体（浓缩型）购自北京中山公司，一抗工作浓度为1∶100。按照试剂操作说明书进行操作，光镜下观察，以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照，具体步骤（略）。
       1.3 结果
       判断在光学显微镜下对切片染色情况进行评估。细胞浆和/或胞核出现棕黄色颗粒者为阳性反应细胞，根据阳性反应细胞所占百分率分为3个等级：（-）无阳性细胞或阳性细胞数＜10%；（+）阳性细胞数为10%～50%，着浅棕色或浅黄色；（++）阳性细胞数≥50%着棕黄色，其中（+）、（++）均记为阳性表达，（-）记为阴性表达。
       1.4 统计学处理将所有数据输入SPSS11.5软件包进行χ2检验，以α=0.05，α=0.01为检验标准。
       　　2 结果
       2.1   Survivin .和 nm23H1在HCC及癌旁肝组织中的表达：①Survivin在HCC中表达率为57.5%，大多数表达产物位于胞浆中，只有2例胞核表达，均呈棕黄色颗粒状，癌旁肝组织中有1例于胞浆中弱阳性表达，表达率为3.85%，两者表达率有非常显著性差异;②nm23H1在HCC中表达率为42.5%，癌旁肝组织中表达率为88.40%，都呈胞浆表达，两者表达率有非常显著性差异。
       2.2 Survivn, nm23H1表达与HCC临床病理特征之间的关系(见表1)。表1    Survivin，nm23H1表达与HCC临床病理特征的关系临床病理特征（略）  
       由表1可见：①Survivin,表达与HCC患者的性别、发病年龄、肿块大小均无关（均P＞0.05），而与HCC的分化程度、转移及癌栓的存在均相关（均P＜0.05）；②nm23H1表达与HCC患者的性别、发病年龄、肿块大小及分化程度均无关（均P0.05），而与HCC的转移、癌栓的存在有相关性（均P＜0.05）。
       2.3 HCC中Survivin,nm23H1两者表达的相关性（见表2）。表2 生存素和,nm23H1表达的相互关系（略）                                                                                   
　　在Survivin呈阳性表达的23例标本中有11例nm23H1呈阳性表达，Survivin呈阴性表达的17例标本中有6例nm23H1呈阳性表达，Survivin表达与nm23H1的表达在HCC中无显著相关性(r=0.125, P＞0.05）。
       　　3 讨论
       HCC是一种常见的消化道肿瘤，研究发现细胞凋亡在HCC发生发展中有重要作用，作为一种新发现的凋亡抑制蛋白Survivin选择性表达于一些恶性肿瘤组织，其与HCC的关系越来越得到关注。Takeshi等［2］用免疫组化的方法研究发现，20例肝癌组织中14例（70%）有Survivin的阳性表达，而表达细胞的数目不等（15%到95%）；而所有的癌旁组织和肝硬化的组织中均无Survivin的表达，在细胞水平的研究发现大部分细胞中Survivin的表达出现在胞核区，仅有少量细胞在胞浆中出现淡染区。本研究结果显示：57.5%（23/40）肝癌组织不同程度地表达Survivin，而在癌旁肝组织中除1例胞浆中呈弱阳性表达外，其余都未表达Survivin，这一结果与国外文献［3，4］报道基本一致，Survivin在HCC及癌旁肝组织中的阳性表达率的差异有非常显著性（P＜0.01），说明Survivin在HCC中有稳定的表达，且表达具有很高的特异性，在HCC的发生发展中起重要作用；本研究还显示，Survivin表达与HCC患者的性别、发病年龄、肿块大小均无关（P＞0.05），而与HCC的分化程度、转移及癌栓的存在均有相关性（P＜0.05），Survivin表达越强，HCC的分化程度越低，发生转移及癌栓的可能性越大，这些提示Survivin在HCC的发展、侵袭转移及预后进展中都起重要作用。
       Survivin是一种能特异性抑制细胞凋亡和调控细胞分裂的蛋白，其编码基因定位于人类染色体17q25上，它通过直接或间接抑制半胱天冬蛋白酶(Caspase)的活性来参与细胞凋亡的抑制作用［5］，使机体细胞在有丝分裂后期避免凋亡，从而促进肝癌细胞的恶性增殖，形成肿瘤或促进肿瘤的发展，细胞的增殖性能增强，促进其向周围组织侵袭性生长或形成癌栓，发生远处转移，朱虹等［6］认为Survivin是通过上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，从而促进HCC的侵袭转移发生。所以，我们认为Survivin可作为反映HCC发生发展及预后判断的主要指标，以及HCC基因治疗的特异性靶点之一。
       Nm23H1被明确是一种人类肿瘤转移抑制基因，其编码基因定位于人类染色体17q21.322［7］，其表达水平与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关，在多种研究中得到证实。Nakayama等［8］用免疫组化检测30例肝癌标本nm23的表达，结果显示原发灶nm23H1表达明显低于癌旁组织，而转移灶比原发灶更低，并与肿瘤大小、数目、组织学分类、相关肝脏良性病变、肝炎病毒标志及肝癌血清标志物无明显关系。国内有人［9］用人肿瘤裸鼠移植模型研究发现在HCC、人骨肉瘤、肾癌等多种不同肿瘤中，nm23H1mRNA均有不同程度的快表达，但较强转移能力的肝癌信号50%为弱阳性，另50%为阳性或强阳性信号，从而说明弱阳性表达可能与人肝癌生长速度及转移倾向相关，提示nm23H1基因不仅是肿瘤抑制基因，而且其突变或缺失也与HCC有一定作用。本实验得出中的结果与Nakayana的结果相一致，主要有：①nm23H1在HCC及癌旁肝组织中表达的差异有非常显著性（P＜0.01），前者为42.50%（17/40），后者为88.40%（23/26），但在癌旁肝组织中多数为强阳性表达（17/23）；②nm23H1的表达与HCC的转移及癌栓的存在有密切相关性（P＜0.01），而与HCC患者的性别、发病年龄、肿块大小及分化程度均无相关性（P＞0.05）。我们认为，nm23H1参与了HCC的发生及侵袭转移过程，其作用机理为［7］：nm23H1蛋白的缺失或减少一方面可使微管聚合异常，引起减数分裂时纺缍体的异常，从而导致癌细胞染色体的非整倍体的形成，促进肿瘤的发生发展；另一方面可能通过影响细胞骨架而引起细胞运动，从而参与HCC的浸润转移过程和发育过程。同时nm23H1还可在信号传导过程中使GDP还原成GTP，从而使G蛋白激活，参与调节大量的细胞介导的细胞信号传导反应，进而参与HCC的发生和发展。
       Nm23H1蛋白参与了HCC的发生发展、侵袭转移过程，nm23H1在HCC和有转移及癌栓存在组中的表达率明显低于癌旁肝组织和无转移及癌栓存在组，显示nm23H1高水平表达可能抑制HCC的发生发展及HCC癌细胞的侵袭转移，从而影响HCC的预后，因而nm23H1蛋白表达水平可作HCC发生发展及预后判断的重要指标，同时nm23H1基因还在研究阐明机理、基因治疗、研究抗转移药物的筛选等方面都有一定的意义。
       因为Survivin、nm23H1作用机理上的差异，两者间的相关性研究就所查文献中罕见报道，但两者与HCC的发生发展、侵袭转移都密切相关，因而检测这两者在HCC的发生发展及侵袭转移作用中是否有协同作用，成为研究的目的之一。研究结果表明，在HCC中，Survivin及nm23H1的表达无显著相关性，是两个互相独立的指标，由此推测肿瘤的侵袭转移是多基因、多因子共同作用的结果。因而在对HCC的发生发展及预后判断中，联合检测这两种指标，对HCC的转移预测并客观评价患者的预后，有一定的提示作用，同时利用这两个靶点进行基因干预，可从两方面抑制HCC的恶性增殖，避免或减少癌细胞的转移和降低癌肿的复发率，这种理想的HCC治疗途径的发展前景值得期待。
       总之，Survivin和nm23H1的表达与HCC的发生发展、侵袭转移密切相关，两种蛋白的表达在HCC的进展中起着重要作用。相信随着其作用机理的深入研究，必将成为HCC治疗和预防的新靶点。                     
       参考文献：
       ［1］周信达.肝癌诊治的若干进展及展望［J］.中华消化杂志，1999，19(1):5.
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       ［3］Smith SD, Wheeler MA , Plescia J , et al. Urine detection of survivin and diagnosis of bladder cancer［J］. JAMA ,2001, 285:324.
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       ［5］ Ambrosini G , Adida C , Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma［J］.Not Med,1997,3：917.
       ［6］朱虹，罗顺峰，张万广，等. Survivin在肝癌中的表达和意义及其与血管内皮生长因子的相关性［J］.中华实验外科杂志，2004，21（2）：208.
       ［7］ Yoshida BA, Sokoloff MM ,Welch DR , et al. Metastasis-suppressor genes: a review and perspective on an emerging field［J］.J Natl Cancer Inst, 2000,92(21):1717.
       ［8］Nakayama T ,Ohtsuru A , Nakao K , el al..Expression in human hepatocellular carcinoma of nucleoside diphosphate kinase, a homologue of  the nm23 gene product［J］. J Natl Canter Inst, 1992, 84(17):1349.
       ［9］宝健中，陈晓冬，王一，等.人肿瘤裸鼠移植瘤株模型转移抑制基因nm23H1mRNA的表达［J］.肿瘤，1997，17（1）：26.
       基金项目：湖北省黄石市科学技术局（No.2005.15）
       作者简介：熊仁海(1973)，男(汉族)，湖北黄石人，现在读武汉大学中南医院硕士研究生，主要从事肝胆外科研究工作.
　
　　(武汉大学中南医院，湖北 武汉430071)
       收稿日期：20050621