珠子参抑制小鼠肝癌及诱导细胞凋亡的研究
作者：胡卫 陈涛
《时珍国医国药》 2005年 第10期
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【关键词】 珠子参
摘要：目的：观察珠子参对小鼠H22肝癌的抑制作用及其机理。方法：建立小鼠肝癌实体瘤和腹水瘤模型，观察珠子参对荷瘤小鼠抑瘤率和生命延长率，放免法(RIA)检测实体瘤小鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF α)含量，流式细胞仪技术(FCM)检测肿瘤细胞凋亡并进行周期分析。结果：珠子参能显著抑制肿瘤生长，抑瘤率达44.89%，且能明显延长荷瘤小鼠生命；珠子参组小鼠血清中TNF α浓度高于正常对照组，而比模型对照组低(P<0.05)；FCM分析显示，珠子参各组G0/G1期和S期细胞(%)减少，而G2/M期细胞和凋亡细胞(%)增加。结论：珠子参对H22肝癌小鼠具有良好的抑瘤作用，其作用机制可能与珠子参阻止G2/M期细胞转换而影响癌细胞在细胞周期中的进程，干扰S期DNA合成以及诱导小鼠肝癌细胞凋亡有关；此外珠子参能明显抑制荷瘤小鼠TNF α水平的异常增高，使其维持在一定水平而发挥抗肿瘤、调节机体免疫力等作用。
关键词：珠子参；肝癌H22细胞株；凋亡；肿瘤坏死因子
Studies of PJ on Inhibition of Proliferation of H22 Cell in mice and Induction of Apoptosis
HU Wei， CHEN Tao
(Medical College of Three Gorges University, Yichang, Hubei 443002, China)
Abstract:Objective:To observe the anticancer action of Panax japlcus var (PJ) on mice liver cancer and its mechanism.Methods:Mouse models of the solid tumor of liver cancer and ascitic liver cancer were established. The inhibitory rate of solid tumor and the life prolongation rate were observed. The cell cycle and apoptosis of the cells were measured by Flow Cytometry (FCM).Radioimmunoassay (RIA) examined the content of TNF α in serum.Results: PJ could obviously inhibit the growth of tumor， the life of ascitic cancer bearing mice was also prolonged. FCM analysis showed:PJ could decrease the number of cells in G0/G1 and S phase and increase the number of cells in G2/M phase and apoptosis cells . The content of TNF-α in serum of PJ group was higher than that of normal control group,but lower than that of model control group.Conclusion:PJ could suppress liver cancer in mice. The anticancer mechanism was probably associated with the arrestment of cell cycle from G2/M phase to G1 phase transition ,interference of DNA synthesis in S phase, and the induction of cancer cell apoptosis. Besides, PJ could inhibit the abnormal elevation of TNF α of tumor bearing mice, and TNF α would maintain at a certain level to take the effect in antitumor and regulation of immunity.
Key words:Panax japlcus var (PJ);Hepatocarcinoma 22 cell line;Apoptosis;TNF α
珠子参Panax japlcus var, major(Burk)C.Y.Wuetk.M.Feng，为五加科人参属植物，具有活血散瘀、补血止血、消肿止痛之功。20世纪80年代以来对其有效成分和药理作用开展了研究，但珠子参在治疗肿瘤方面的报道尚属空白。根据珠子参民间应用的经验及其成分和药理作用的分析，我们率先开展了珠子参抗肿瘤作用的实验研究，结果显示该药具有较好的抑瘤功效。在珠子参治疗肝癌的实验中，观察到珠子参对体外培养的人肝癌细胞(SMMC 7721)有良好的抑制作用，并且形态学观察显示该药能明显诱导肝癌细胞凋亡。在此基础上，我们进一步研究了珠子参对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤效应和诱导肝癌细胞凋亡的作用，并通过分析细胞周期来揭示其抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡的可能机理。
1材料
1.1实验动物与细胞株昆明种封闭群小鼠：雄性，质量(22±2)g，共110只。购自湖北省实验动物中心。(许可证号：SCXK(鄂)2003－0005)
H22细胞株：华中科技大学同济医学院药学系曾凡波老师惠赠，接种于Km小鼠腹腔内传代保。
1.2主要药品与试剂珠子参 ：购于宜昌市久康药房，经宜昌市药检所鉴定；产地：神农架；批号：2002015 氟尿嘧啶(5 FU)（天津氨基酸公司人民制药厂）：针剂，250mg/支，灭菌生理盐水稀释至一定浓度，避光常温保存，用作阳性对照物。肿瘤坏死因子(TNF α)放免分析药盒：购自北京北方生物技术研究所；Coulter DNA Prep Reagents Kit：购自coulter公司，批号：760204K。
1.3主要仪器DFM 96型10管放射免疫计数器；流式细胞仪(EPICS型)：美国Beckman coulter 公司；自动平衡离心机(LDZ5 2型)：北京医用离心机厂；电子天平(MP200A型)：上海良平仪器厂。
2方法与结果
2药物和小鼠肿瘤模型制备
2.1.1药物制备珠子参水煎液：珠子参根茎烘干称重，研磨成粗粉，装入圆底烧瓶内加10倍体积蒸馏水浸泡2 h，然后将圆底烧瓶置于电子恒温水浴锅中，恒温80℃加热8 h后，中性滤纸过滤后弃掉药渣，将所得的药液进一步浓缩至终浓度为0.66 g/ml(即1 ml药液中含原生药0.66 g)。分装于灭菌试管，4℃冰箱保存备用。5 FU：在超净工作台避光条件下，无菌生理盐水稀释5 FU针剂至2.5 mg/ml后分装于EP管并用锡纸遮盖保存于4℃冰箱。
2.1.2动物模型的制作实体瘤：肝癌H22细胞株昆明小鼠体内连续传代3代后，抽取接种7 d左右种鼠腹水，呈乳白色，D Hanks液洗涤离心(800 r/min×5 min)3次，调整细胞浓度至1.0×107个/ml，台盼蓝拒染法检测存活率≥95%，将细胞悬液注射至健康小鼠右腋皮下，每鼠0.2 ml。全程严格无菌操作，40 min内完成。(腹水瘤为细胞悬液注入腹腔)
2.1.3动物分组及给药昆明小鼠分笼饲养，自由摄食与饮水。造模后随机分组：模型组，模型+珠子参组(简称珠子参组)，模型+ 5 FU组(简称5 FU组)，珠子参组又分为高浓度和低浓度两组。造模后第2天起，珠子参高浓度组每只小鼠按10 g/kg体重灌胃给药，珠子参低浓度组每只小鼠按5 g生药/kg体重灌胃给药，连续10 d；同时给予模型对照组和5 FU组每只小鼠分别灌胃等体积生理盐水。5 FU组每只小鼠按0.5 mg/20 g体重腹腔注射给药，连续5 d；同时给予模型对照组和珠子参各组每只小鼠腹腔注射等体积生理盐水。
2.2对小鼠肝癌实体瘤的抑制作用抑瘤率和胸腺指数给药结束后第2天，称重后摘除眼球法取血处死小鼠，完整剥离肿瘤组织和胸腺，电子天平称重，计算抑瘤率和胸腺指数。
抑瘤率=(1-实验组肿瘤质量 模型组肿瘤质量)×100%胸腺指数=胸腺质量(mg) 小鼠质量(g)×10
结果如表1，表2。与模型对照组相比，珠子参各组和5 FU组小鼠平均肿瘤重量均显著降低(P<0.01)；与模型对照组相比，珠子参各组小鼠胸腺平均重量和胸腺指数均高于模型对照组；与5 FU组比较，珠子参组平均胸腺重量和胸腺指数均高，且结果有显著差异(P＜0.01或P＜0.05)
表1珠子参对 H22荷瘤小鼠瘤重的影响（±s）（略）
表2珠子参对H22荷瘤小鼠胸腺重量和胸腺指数的影响（±s）（略）
2.3对腹水型肝癌小鼠生命延长的作用生命延长率从造模之日起记录小鼠生存天数，计算各组小鼠生命延长率(ILS)。只统计接种后生存至取腹水检查后的小鼠。
ILS=(治疗组平均生存天数 对照组平均生存天数 对照组平均生存天数)×100%
结果见表3，珠子参高、低浓度能不同程度延长肝癌腹水瘤小鼠的生存期，与模型对照组相比，结果有统计学差异。
表3珠子参对荷腹水瘤小鼠生存天数的影响(±s)（略）
表5珠子参对肿瘤细胞周期和凋亡的影响（略）
2.4TNF α活性检测RIA法检测小鼠血清中TNF α浓度：实体瘤小鼠摘除眼球取血，37℃孵育促凝血，1 500 r/min离心数次至血清析出，取上清送至第一临床医学院放免科检测。结果见表4。与正常对照组相比，珠子参组和5 FU组血清TNF α水平升高，但无统计学差异，而模型对照组血清TNF α水平显著高于其他各组(P＜0.05)。
2.5流式细胞仪检测细胞DNA含量并进行周期分析取各组小鼠腹水细胞，离心(800 r/min×5 min)洗涤3次，调整细胞浓度为1×106 个/ml，4℃70%的乙醇固定30 min，用含Rnase及碘化丙啶(PI)染色液染30 min后上流式细胞仪检测DNA含量的变化，并用Multicycle软件分析细胞周期变化。表5的结果显示：珠子参能诱导肝癌细胞凋亡，其中珠子参高浓度组诱导的细胞凋亡率最高。模型对照组细胞的凋亡为肿瘤细胞自发的凋亡。从周期分析结果可以看出，珠子参可使G2 M期细胞聚积，阻止了M- G1 期的转换，从而干扰了小鼠肝癌H22细胞在细胞周期中的进程。同时，珠子参能使S期细胞减少，可能与干扰了癌细胞DNA合成有关。
3讨论
原发性肝癌(简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一，是目前实体瘤中预后较差的恶性肿瘤，且缺乏有效的治疗方法和手段。为此，开展中医药诊治肝癌的研究，研制和开发治疗肝癌的高效低毒药物，具有重要的意义。
本研究结果显示，珠子参在5g生药/kg和10g生药/kg剂量下灌胃给药，对小鼠移植性肝癌实体瘤具有较好的抑瘤效果，光镜下肿瘤细胞周围较多见淋巴细胞浸润，而且对腹水瘤小鼠具有延长生存期的作用。其作用机理可能与珠子参诱导肝癌细胞凋亡和影响细胞周期以及调节TNF-α水平有关。
细胞凋亡是在一定的生理或病理条件下，细胞受到某种信号的触发后主动参与并遵循一定程序的死亡过程，在整个过程中发生一系列特殊基因的改变及生化、形态特征的改变。肝癌细胞的凋亡在肝癌的发生发展，转归及治疗等方面发挥着重要的作用。珠子参诱导肝癌细胞凋亡可能与其细胞毒作用一起发挥抗癌效应。周期分析结果表明：珠子参可使G2/M期细胞聚积，阻止了M/G1期的转换，从而干扰了小鼠肝癌H22细胞在细胞周期中的进程。同时，珠子参能使S期细胞减少，可能与干扰了癌细胞DNA合成有关。
TNF α主要产生于单核巨噬细胞，具有抗肿瘤、抗病毒及免疫调节等广泛的生物学效应。但TNF α的生物学作用与其体内的水平高低密切相关，临床上实体瘤患者血清TNF α水平异常升高，会严重破坏细胞因子之间正向的协调作用，造成细胞因子网络功能紊乱，并可引起脂肪降解、血管渗漏、内源性致热等病理损伤。本次实验结果显示：珠子参组TNF α水平高于正常组与5-Fｕ组，但显著低于模型组，表明珠子参具有抑制荷瘤机体TNF α水平异常升高的作用，使其维持在一定水平而发挥抗肿瘤、调节机体免疫功能等积极作用,至于其最佳水平范围则有待进一步探明。
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(三峡大学医学院，湖北 宜昌443002)