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       【关键词】  高效液相色谱
       摘要：目的建立跌打活络微乳中蛇床子素含量的测定方法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱：Diamonsil钻石C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇水（80∶20），检测波长：322 nm；流速：1 ml/min。结果蛇床子素在0.042~ 0.336 μg线性关系良好，r=0.999 7，平均回收率为100.91%，RSD为2.42%(n=6)。结论该法操作简便，结果准确，灵敏度高，重现性好，可用于该制剂的质量控制。
       关键词：跌打活络微乳；高效液相色谱法；蛇床子素
                        
　　Determination of Osthole in Dieda Huoluo Microemulsions by HPLC
       WANG Lisheng， ZHAN Jiankun， ZHOU Liling
       （1.College of Traditional Chinese Materia Medica, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China; 2.Grade 2002 Undergraduate of Pharmaceutical Engineering, College of Traditional Chinese Materia Medica, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China）
       Abstract：ObjectiveTo establish the determination method for osthole in Dieda Huoluo Microemulsions. MethodsHPLC was used with DiamonsilC18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), detection wavelength at 322 nm, mobile phase: methanol-water (80∶20), flow rate: 1ml/min. ResultsOsthole has good linear relationship between 0.042~0.336 μg, r=0.999 7, the recovery of osthole was 100.91% and RSD was 2.42% (n=6). ConclusionThe method is simple, sensitive and reliable to carry out to control the quality of this preparation.
       Key words：Dieda Huoluo Microemulsions; HPLC; Osthole
       跌打活络膏是由蛇床子、红花、大黄等几味中药材制成，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛生肌、舒筋活络的功效，临床用于治疗跌打损伤、水火伤烫伤、扭伤、挫伤、瘀血疼痛等疗效显著。为了提高疗效，便于患者使用，根据各药材的性质、原制法及作用特点，采用超临界萃取技术提取药材中的有效部位，与处方中的挥发油组成油相，并制成O/W型微乳。蛇床子为处方中主要药物之一，蛇床子素为蛇床子的生物活性成分［1］，为了控制跌打活络微乳的质量，保证药品的质量及临床疗效，本文建立了高效液相色谱法测定蛇床子素含量的方法。
       　　1 仪器与试药
       戴安summit P680高效液相色谱仪，summit P680A低压四元泵，PDA100二极管阵列检测器，ASI100自动进样器，summit柱温箱，Chromeleon色谱工作站；Shimadzu Libror AEL 40SM(十万分之一)天平（日本岛津所）；Aquapro实验室级台式超纯化水机（重庆颐洋企业发展公司）。
       甲醇（色谱纯）；水（超纯水，临用前制备）；蛇床子素（中国药品生物制品检定所提供，含量测定用，批号：0822200204，纯度检查为99.7%)；其它试剂均为分析纯。
       　　2 方法与结果
       2.1 色谱条件与系统适应性实验色谱柱：Diamonsil钻石C18 5 μm，250 mm×4.6 mm色谱柱；柱温：25℃；流动相：甲醇水(80∶20)；检测波长：322 nm［2］；流速：1 ml/min；进样量：10μl。在选定色谱条件下，测得蛇床子素对照品的保留时间约10.3 min；供试品色谱中蛇床子素峰与杂峰分离效果良好，分离度大于2.0；理论塔板数按蛇床子素峰计算应不小于3 000；阴性对照色谱在相应位置上无干扰峰。见图1。
       2.2 对照品溶液的制备  精密称取蛇床子素对照品10.5 mg于25 ml的棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，制成0.42 mg/ml的蛇床子素对照品储备液；再精密吸取此液1 ml至25 ml的棕色量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，得0.016 8 mg/ml的蛇床子素对照品溶液。
       2.3 供试品溶液、阴性对照溶液的制备精密量取本品2 ml至10 ml的棕色量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜0.45μm滤过，取续滤液，即得。另按处方比例和样品制备工艺制成不含蛇床子的阴性微乳，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。
       2.4  线性范围的考察
       精密吸取蛇床子素对照品储备液0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0 ml置25 ml的棕色量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀；分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，以峰面积(mAU・min)为纵坐标，进行回归处理，得标准曲线方程：Y=49.75X＋0.387 3，r=0.999 7；结果表明在0.042~0.336 μg范围内，蛇床子素的峰面积与进样量呈良好线形关系。
       2.5 最低检出限实验　
       在本色谱条件下，使蛇床子素峰高为仪器响应噪声的3倍高，测得蛇床子素的最低检出量约为0.1  mg。
       2.6 精密度与稳定性实验　
       精密吸取上述对照品溶液（浓度：0.016 8 mg/ml）10 μl，重复进样6次。依法测定蛇床子素的峰面积，计算RSD= 0.26%，说明仪器的精密度良好；另取同一供试品溶液在12 h内，每相隔2h进样，依法测定蛇床子素的峰面积，计算RSD=0.84%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
       2.7 重现性实验分别精密称取同一批样品5份，按供试品溶液的制备方法配制，依法测定，计算蛇床子素含量，RSD=1.83%，测定结果说明，蛇床子素含量测定结果重现性良好。
       2.8  加样回收率实验精密量取6份含量为0.103 mg/ml的本品1ml容量瓶中，精密梯度加入蛇床子素对照品溶液（浓度：0.105 mg/ml），按含量测定项下的条件和方法测定，计算回收率，结果见表1。表1 回收率实验结果样品量（略）
       2.9 样品测定
       取3批样品，按供试品溶液的制备方法配制，依法测定蛇床子素的含量，结果见表2。表2 样品中蛇床子素含量测定（略）
       2.10 浸膏测定取2.9项下的同批样品的浸膏，称取1/10处方量的浸膏重量，用无水乙醇溶解并稀释至100 ml。精密量取2  ml至10 ml的棕色量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜0.45μm滤过，取续滤液，即得浸膏的供试品溶液。精密吸取10 μl进样，测定蛇床子素的含量，结果见表3。表3 浸膏中蛇床子素含量测定（略）
       　　3  讨论
       3.1 根据实验结果，考虑到药材来源及药品的生产、贮藏等因素，初步按实测量的60%作为最低限度，暂定本品每毫升含蛇床子素不得低于0.06 mg。本制剂蛇床子素从浸膏到微乳中的转移率达96%以上，说明在微乳成型过程中，有效成分具有较高的保留率。因此，微乳是一种值得推广应用的液体制剂。
       3.2  有文献报道蛇床子素见光易分解，而在避光保存的情况下其分解速度大大减慢［3］，本实验采用避光操作，且在实验前临时处理样品。蛇床子素在乙醇中比甲醇中稳定，本实验蛇床子素对照品采用乙醇溶解［4］。
       3.3 张志荣［4］等报道，在测定复方蛇床子胶囊时，流动相中加入四氢呋喃后峰形较好，实验结果得到证实。但本品含量测定时，流动相中加入四氢呋喃后，则会产生白色絮状沉淀，柱压急剧升高。本实验中直接用甲醇水能达到良好的分离效果，故采用甲醇水（80∶20）为流动相。
       3.4 本法简便，准确，重复性好，可作为该制剂的质量控制指标。
       　　参考文献：
       ［1］张新勇，向仁德.蛇床子化学成分的研究［J］.中草药，1997，28(10):588.
       ［2］李社花，何继祥，程静，等.反相高效液相色谱法测定妇安肤灵洗液中蛇床子素含量［J］.药物分析杂志，2002，22(3)：242.
       ［3］陈艳平，霍明，陈艳明，等.RPHPLC测定蛇床子和妇炎灵胶囊中蛇床子素的含量［J］.中成药，2003，25(3)：196.
       ［4］张志荣，胡海燕.HPLC测定复方蛇床子胶囊中的蛇床子素［J］.中国药学杂志，1998，33(12)：745.
       基金项目：国家自然科学基金“中药经皮给药系统局部药动学研究” （No.30371783）
       作者简介：王利胜(1968)，男(土家族)，湖北利川人，现任广州中医药大学中药学院副教授，硕士生导师，博士学位，主要从事中药药剂学、中药新药教学与研究工作.
       (1.广州中医药大学中药学院，广东 广州510405；2.广州中医药大学中药学院2002级制药工程，广东 广州 510405)
       收稿日期：20050608；