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       【关键词】  小儿
       摘要：目的观察小儿退热贴的祛邪作用，为临床治疗小儿外感发热提供实验依据。方法采用给药清除流感A型病毒感染小鼠体内病毒的方法，观察小儿退热贴对流感A型病毒感染小鼠的存活率、平均存活时间、肺指数及血凝滴度的影响；体外抗流感病毒试验采用MTT法检测病毒抑制率；体外抑菌实验(MIC测定法)观察小儿退热贴对肺克杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、肺炎球菌的抑制作用；采用给药治疗葡萄球菌感染小鼠的方法，观察小儿退热贴对葡萄球菌感染小鼠的死亡率的影响。结果小儿退热贴1.04 g・kg1・d1可提高流感病毒A型感染小鼠的存活率、延长其存活时间，肺指数和血凝滴度与病毒对照组相比较具有显著性差异；小儿退热贴在浓度5～1 280 μg/ml的范围内，随浓度的增加，对流感病毒的抑制率也增加，并表现出量效关系；小儿退热贴含生药量0.83 g/ml对肺克杆菌有较强的抑制作用、含生药量0.11 g/ml对绿脓杆菌有较强的抑制作用、含生药量0.06 g/ml对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用、对乙型链球菌和肺炎球菌没有抑制作用；小儿退热贴可降低金黄色葡萄球菌感染小鼠的死亡率，与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。结论小儿退热贴具有体内外抗病毒、抑菌的作用。
       关键词：小儿退热贴；抗病毒；抑菌
       Experimental Study on Eliminating Pathogenic Effects of Infantile Umbilical Paste
       ZHANG Guobin
       (Hubei College of Traditional Chinese Medicine,  Wuhan  430061, China)
       Abstract:ObjectiveTo provide an experimental evident for clinical  treating infantile fever, we observed the eliminating pathogenic effects of infantile umbilical paste.MethodsWe applied the method of giving the medicine to mice infected by influenza virus A to detect some indexes, including survival rate, mean survival time, lung index, hemagglutination titer, to evaluate the effects of eliminating virus in vivo; We applied MTT method to detect protect rate of virus in vitro; In another experiment, we evaluated the medicine inhibition to Klebsiella Pneumoniae  bactedostatic，P.aeruginosa, acpococcus，beta-streptococcus，preumococcus in  vitro. We gave infantile umbilical paste  to  mice infected by acpococcus to evaluate the medicine effects on mice mortality.ResultsThe group of infantile umbilical paste (1.04 g/kg)  can increase survival rate of mice infected by influenza virus prolong survial time, and its lung index and hemagglutinati on tier have a signincant difference compared with the group only treated with virus；Within the range of 5～1280 μg/ml，when the medicine concentration increased，protect rate on group of infantile  umbilical  paste (0.83 g/ml) has stronger inhibiting  effects  on Klebsiella  Pheumoniae，0.11 g/ml has stronger inhibiting effects  on P.aemginoSa，0.06 g/ml has  stronger inhibiting effects on acrococcus，and it has little effects on beta-streptococcus and preumococus；The medicine can bring down monality of mice infected by acrococcus. It has significant difference compared with the control group without medicine (P＜0.01).ConclusionInfantile umbilical paste has anti-virus and inhibiting bacteria effects in vitro and in vivo.
       Key words:Infantile  Umbilical Paste； Anti-virus；Anti-bacteria
       小儿退热贴是由栀子、银莲花、胡黄连、人工牛黄等中药制成的贴剂，敷于小儿脐部，临床用于治疗外感发热，系由六淫之邪侵袭肌表、邪正相争、营卫失和、阳盛于外所引起的证候以及西医的感冒、流行性感冒等急性上呼吸道感染。根据外感热证的中药应具有驱逐病邪、解除表证等功效，设计了以下实验。
       　　1小儿退热贴体内抗流感病毒实验
       1.1材料
       1.1.1  病毒流感病毒A型H2N3株由武汉大学医学院病毒学研究所保存。毒种经鸡胚反复三代增毒，病毒血凝滴度达1∶1 280。将病毒转种Veto细胞，再反复传代适应，增殖，培养出Vero细胞上的稳定适应株，测定其病毒半数致细胞病变剂量(TCID50)为10~5.0/0.1 ml。经此处理增殖的H2N3型病毒增殖周期为1～2 d，血凝试验检测适应株血凝滴度可达1.320以上，同时经血凝抑制实验证实活化增殖的病毒为A型流感病毒。
       1.1.2 动物昆明种小鼠由武汉大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证为SCXK(鄂)2003-0004。小鼠日龄为60 d，体重 （20±1)g   雌雄各半，给药前观察l～3 d，无异常表现的小鼠选为受试对象。
       1.1.3 药物小儿退热贴浸膏：每克浸膏含生药4.5 g，浓度为30％，湖北中医学院生产，批号：20030707；阳性药物：病毒唑(Ribavirin，天津药业涟水有限公司，批号0103071)。
       1.2 方法与结果［1，2］
       1.2.1 流感病毒A型H2N3株致小鼠半数死亡(LD50)测定将病毒进行10倍连续稀释(10-1～10-8)，每个浓度接种4只小鼠(鼻吸和腹注导入)，观察2周，记载小鼠发病、死亡情况，推算出LD50值。小鼠感染病毒后，经过短暂潜伏期(7 d左右)，便进入发病状态。体征一般从厌食、呆滞和嗜睡等精神症状开始，继而出现畏寒(隆身、群聚)、发热(耸毛、耳部末稍血管充血)和呼吸道分泌物增多(不时捞鼻)等体征，最后发展成肺炎直至死亡等递进变化经滴定该病毒的半数致小鼠死亡毒力(LD50)为10-5/0.2 ml。   
       1.2.2小儿退热贴外敷对小鼠药毒耐受量测定分别用相当于成人药量(0.755 g/kg/d)的60和20倍(45.3和15.1生药g/kg)高浓度用量的小儿退热贴各对10只小鼠灌胃，1 d，连续6 d，追踪观察2周，并记录动物反应和死亡情况。实验表明小儿退热贴成人剂量60倍及20倍药量小鼠灌胃，连续6d，观察2周，小鼠无一死亡，其全身状况、饮食、摄水、大小便和体重增长均正常。
       1.2.3 小儿退热贴对小鼠体内抑病毒实验实验共设7组，每组10只。分别为小儿退热贴3个剂量，即大剂量(1.04 g・kg-1・d-1) ；中剂量(0.52 g・kg-1・d-1)和小剂量(0.26 g ・kg-1・d-1)。另设小儿退热贴赋型剂(基质)组(2.00 g・kg-1・d-1)，病毒唑治疗组(0.25 g・ kg-1・d-1)，病毒感染组和正常对照组。动物室保持空气新鲜，维持相对湿度60％，温度(20±4)℃，给药部位常规消毒，给药组、病毒感染组和正常对照组分开喂养观察。小儿退热贴给药组和基质组的小鼠腹部经脱毛剂(含硫化钡、面粉、滑石粉和肥皂粉)脱毛，病毒剂量采用致死剂量(100LD50)0.4 ml/只，经鼻吸入及腹腔注射种入，24 h后开始给药，小儿退热贴给药组和基质组小鼠腹部外敷药物并固定8 h，病毒唑组腹腔注射给药所有治疗组连续给药7 d。每日观察动物的反应，出现死亡时间和死亡数。所有动物用药后观察14 d。称量各组小鼠的体重及肺重，计算肺指数，并对肺组织进行病毒血凝试验，基本程序是将肺组织制成匀浆接种鸡胚，2～4 d收集尿囊液，倍比稀释后与鸡红细胞悬液混合孵育，1 h后观察红细胞凝集情况并计算出病毒血凝滴度。结果见表1。表1 小儿退热贴对流感病毒A型感染小鼠的治疗效果（略）
       流感病毒A型H2N3株感染小鼠经小儿退热贴治疗后，动物有三种结局：一是感染后出现发病症状，几天后衰竭死亡；第二是出现发病症状，治疗后又恢复正常；第三是感染后不出现任何症状，与未感染病毒的对照小鼠一样，发育正常。
       小儿退热贴对流感病毒A型感染小鼠存活率、平均存活时间、肺指数及血凝滴度的影响。结果见表1。
             
　　血凝滴度的倒数；单因素方差分析：病毒对照组与病毒唑、小儿退热贴组(高)比，P＜0.05；病毒唑与小儿退热贴组(高)比P＞0.05；*χ2检验：小儿退热贴组间，P＜0.05；#行×列表确切概率法检验：小儿退热贴组与病毒唑比，P＞0.05；小儿退热贴组与病毒对照比，P＜0.05；△秩和检验：小儿退热贴组(小)、基质与病毒对照组比，P＞0.05，小儿退热贴组(中、高)、病毒唑与病毒对照组比，P<0.05；小儿退热贴组(小)；与病毒唑比，P＞0.05，小儿退热贴组(中、高)与病毒唑比，P＜0.05　从存活率和平均存活时间看，各组动物间显示出明显差异，从表1可知小儿退热贴1.04 g・kg-1・d-1时可使流感A型病毒感染小鼠的存活率达60％，与已知具有治疗效果的病毒唑比较，P>0.05。正常对照动物均未死亡，存活率100％。
       小儿退热贴对流感A型病毒感染小鼠体内病毒的清除作用，从表1可知，小儿退热贴能清除流感A型病毒感染小鼠体内的病毒，肺指数和血凝滴度均显示有量效关系。
       　　2 小儿退热贴体外抗流感病毒实验
       2.1 材料
       2.1.1　病毒流感病毒A型H2N3株，由武汉大学医学院病毒学研究所保存。毒种经鸡胚反复三代增毒，病毒血凝滴度达1∶1 280。将病毒转种Vero，再反复传代适应，增殖，培养出Vero上的稳定适应株。经此处理增殖的H2N3型病毒增殖周期为1～2 d，血凝实验测适应株血凝滴度可达1∶320以上，同时经血凝抑制试验证实活化增殖的病毒为A型流感病毒。
       2.1.2细胞非洲绿猴肾细胞(Vero)。
       2.1.3 药物小儿退热贴浸膏：每克浸膏含生药4.5 g,浓度为30％，湖北中医学院生产，批号：20030707；阳性药物：病毒唑(Ribavirin，天津药业涟水有限公司，批号0103071)。
       2.2 方法与结果［1，2］
       2.2.1 病毒毒力测定Vero细胞于96孔培养板单层培养，将病毒10倍稀释，0.l ml/孔，重复10次，37℃，5％CO2培养2 d，观察细胞病变(CPE)，测定病毒半数致细胞病变剂量(TCID50)。按照Reed-Muench氏法计算，本实验用流感病毒A型H2N3株TCID50=10-5/0.1 ml。结果见表2。表2  流感病毒A型H2N3株毒力测定病毒稀释度（略）    
       2.2.2 药物毒性测定Vero细胞生长呈单层，将小儿退热贴浸膏倍比稀释，浓度为25.6，12.8，6.4，3.2，1.6，0.8，0.4，0.2，0.1 mg/ml，每一稀释浓度重复3次，同时设正常细胞对照，37℃，5%CO2培养，观察CPE，采用MTT法，在培养48 h的细胞中，加入含MTT 5 mg/ml的培养液，0.0l ml/孔，继续培养4～6 h，加入二甲亚砜(DMSO)，0.1 ml/孔，测定570 nm波长下的吸光度(A值)。按下列公式计算细胞存活率，并用统计软件SPSSll.5的Probit回归法计算出小儿退热贴浸膏致细胞半数中毒浓度(TC50)。结果见表3。表3 小儿退热贴浸膏致Vero细胞病变和细胞存活率的影响观察（略）  
       小儿退热贴浸膏所致Vero细胞的毒性表现为细胞增殖缓慢，胞质颗粒增多，形态改变，折光性增强，但仍可贴壁。实验显示该药毒性仅在浓度＞0.1 mg/ml才呈现。MTT比色法测定，按Reed-Muench氏法计算小儿退热贴浸膏TC50为10.22 mg/ml(直线回归Y=77.590 9-2.659 85X)，通过实验可知小儿退热贴浸膏浓度≤0.1 mg/ml对细胞生长无明显影响。
       2.2.3 体外抗流感病毒实验Vero细胞生长呈单层于96孔培养板，加入l00TCID50病毒液，0.1 ml/孔，37℃、5％ CO2吸附1 h，弃去病毒液，加入TC50(10.22 mg/m1)的1/10倍稀释5个浓度的小儿退热贴浸膏，以4倍倍比稀释，即分别为1 280，320，80，20，5 μg/ml,并设病毒对照(不加药液)，细胞对照(不加病毒)，受试药物和阳性药物对照组(细胞不加病毒，加相对应不同浓度的药液)。每一浓度重复3次，37℃、5％CO2培养48 h，观察细胞病变，记录病变程度，待病毒对照细胞病变达75％以上时为实验终点，用MTT法检测病毒抑制率，按照统计软件SPSS11.5的Probit回归法计算IC50。结果见表4。表4不同浓度小儿退热贴浸膏对A型流感病毒H2N3株的抑制作用项目 （略）
       病毒抑制率=［实验组(药物＋病毒)平均A值病毒对照组平均A值］/(药物组平均A值病毒对照组平均A值)×100％
          
　　结果表明小儿退热贴浸膏在体外有明显抑制流感病毒的作用，表现在：①病毒性特异性CPE在用药组呈现抑制效应；②随着药物浓度的增加，细胞皱缩、变圆、脱落、碎裂等CPE特征逐渐减弱，病毒的感染性滴度明显下降(病毒抑制率增加)。在浓度5～1 280 μg/ml的范围内，随着药物浓度的增加，对流感病毒的抑制率增加，并表现出量效关系；③小儿退热贴浸膏对流感病毒IC50为82.28 μg/ml(直线回归Y=53.299 5+0.040 1X)，与具有抗流感病毒作用的病毒唑比较(40 μg/m1)，抑制流感病毒作用无明显差异(P＞0.05)。
       　　3  小儿退热贴体外抑菌实验(MIC测定法)
       3.1  材料
       3.1.1 菌种金黄色葡萄球菌(26001)：北京药品生物制品检定所提供；肺克杆菌(ATCC700603)：北京药品生物制品检定所提供；绿脓杆菌(R1-5)：武大菌种保藏中心提供；肺炎球菌(31001)：同济医大提供；乙型链球菌(ws-398)：同济医大提供。
       3.1.2 培养营养培养基(金黄色葡萄球菌，肺克杆菌，绿脓杆菌)；8％兔血清液体培养基(肺炎球菌，乙型链球菌)。
       3.2 方法和结果［3，4］
       3.2.1方法药物：每一实验菌株分别排试管10支，于第1管加液体培养基3.2 ml，其他每管2 ml。于第十管内加受试药液0.8 ml，混匀，吸取2 ml移至第1管，混匀，吸取2 ml移至第3管，依次类推，直至第8管，然后吸取2 ml弃去。原药浓度为每毫升含4.15 g(药液依次稀释后的浓度分别为5，10，20,40,80 160，320，640倍；最后每毫升含生药量依次为0.42,0.21,0，11,0.06,0.03,0.015,0.008 g)。
       菌种：通过3次传代，最后取16～18 h 培养物稀释成含菌量为1×107/ml的浓度备用。于上述稀释好药物的试管内依次加入上述备用菌液每管0．1ml至第八管。第九管为阴性对照，第十管为阳性对照。然后置37℃箱培养18～24 h取出观察细菌生长情况，以无菌生长的最小药物稀释度管为该药物对该检菌的抑菌浓度(MIC)。
       3.2.2 结果观察结果见表5～9。根据以上MIC实验结果小儿退热贴对肺克杆菌每毫升含生药量0.83 g有较强的抑制作用、小儿退热贴对绿脓杆菌每毫升含生药量0.11 g有较强的抑制作用。小儿退热贴对金黄色葡萄球菌每毫升含生药量0.06 g有较强的抑制作用。小儿退热贴对乙型链球菌，肺炎球菌没有抑制作用。表5 绿脓杆菌实验结果（略）表6 金黄色葡萄球菌实验结果 （略）表7 肺克杆菌实验结果（略）表8 肺炎球菌实验（略）表9 乙型链球菌实验结果（略）
       　　4  小儿退热贴对葡萄球菌感染小鼠的治疗作用
       4.1 材料
       4.1.1  动物昆明种小鼠，（18～22）g，雌雄各半。由武汉大学实验动物中心提供，生产许可证：SCXK(鄂)2003-0004。
       4.1.2 菌种金黄色葡萄球菌(26001)北京药品生物制品检定所提供。培养6 h，浓度约为9×108/ml。然后将菌液用生理盐水以10倍顺序稀释成为10-1，10-2，10-3，10-4…不同稀释度的菌液，供动物感染用。
       4.1.3 小儿退热贴小儿退热贴浸膏：每克浸膏含生药4.5 g,浓度为30%，湖北中医学院生产，批号：20030707。
       4.2   方法和结果［5］
       4.2.1 预实验将不同浓度的菌悬液分别腹腔注射于小鼠，每浓度组3只，每只0.5 ml，观察动物在4 d内的死亡情况。正式实验引起小鼠80％～100％死亡的菌液浓度进行感染。
       4.2.2 分组取18～22 g的小鼠，随机分为6组，每组20只，各组小鼠（正常对照组除外)腹腔注射菌液0.5 ml/只，于注射前一天开始给药。分组情况如下：①小儿退热贴高剂量组1.04 g/kg；②小儿退热贴中剂量组0.52 g/kg；③小儿退热贴低剂量组0.26 g/kg；④阳性对照组皮下注射青霉素2×104 u/只；⑤阴性对照组脐部敷基质2.0 g/kg，1次/d。
       4.3  结果观察统计4 d内各组动物死亡率。结果见表10。表10 小儿退热贴对葡萄球菌感染小鼠的治疗作用 （略）                                   
       结果表明，小儿退热贴各剂量组均可降低金黄色葡萄球菌感染小鼠的死亡率。
       　　5 结论
       体内抗流感病毒A型H2N3株实验显示，小儿退热贴1.04 kg/d可提高流感毒A型感染小鼠的存活率，延长其存活时间；肺指数和血凝滴度与病毒对照组相比较具有显著性差异，提示小儿退热贴能清除A型流感病毒感染小鼠体内的病毒。体外抗流感病毒结果显示，小儿退热贴有明显抑制体外病毒的作用；在浓度5～1 280 μg/L范围内，随药物浓度的增加，对流感病毒的抑制率也增加，并表现出量效关系。体外抑菌实验显示，小儿退热贴每m1含生药量0.83 g对肺克杆菌有较强的抑制作用，每毫升含生药量0.11 g对绿脓杆菌有较强的抑制作用，每m1含生药量0.06 g对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，对乙型链球菌、肺炎球菌没有抑制作用。体内抑菌 实验显示，小儿退热贴可降低葡萄球菌感染小鼠的死亡率，与模型对照组比较，χ2检验有显著性差异。
       　　6 讨论
       内病外治是中医常用的治疗方法。因考虑到小儿口服中药制剂难度较大，小儿退热贴将药物敷于小儿脐部、透皮吸收从而达到治疗目的。小儿退热贴采用内病外治的方法，解决了小儿大剂量口服中药的困难。从实验结果可以看出，该方法行之有效；同时，小儿退热贴外用具有良好的祛邪作用，体内外抗病毒、抑菌效果显著，为该药开发成中药6类新药提供了实验依据。
       　参考文献：
       ［1］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：1723.
       ［2］中华人民共和国卫生部药政局．新药(西药)临床前研究指导原则汇编［S］.1993：170.
       ［3］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1993：277.
       ［4］ 浙江省千里光协作组.千里光抗菌作用的实验研究和临床疗效观察［J］.中华医学杂志，1993，(10)：628.
       ［5］李仪奎.中药药理实验方法学［J］.上海：上海科学技术出版社，1991：292.
          作者简介：张国斌(1980)，男(汉族)，山东莱州人，现在读湖北中医学院2003级硕士研究生，主要从事中药药理学研究工作.
       (湖北中医学院，湖北 武汉430061)
       收稿日期：20041206；