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       【关键词】  鱼腥草
       摘要：目的研究鱼腥草挥发油脂质体肺靶向效果给药。方法酰化磷脂以逆相蒸发－搅拌超声法制备鱼腥草挥发油脂质体，过柱分离检测包封率，显微镜法观察形态，最后通过小鼠静脉注射给药0.5 h后，肺部提取药物，通过气质联用和抑菌圈实验比较脂质体与乳剂给药浓度。结果鱼腥草挥发油脂质体药物包封率达94.77％，鱼腥草挥发油脂质体呈双层结构，其平均粒径为97 nm，鱼腥草挥发油脂质体给药后肺脏提取液中未检出甲基正壬酮，而亚油酸乙酯质量分数为0.259％，鱼腥草挥发油乳剂给药时两者均无，鱼腥草挥发油脂质体给药后肺脏提取液抑菌圈直径可达1.2 mm，鱼腥草挥发油乳剂给药时抑菌圈最大仅为0.5 mm。结论以逆相蒸发－搅拌超声法制备鱼腥草挥发油纳米酰化磷脂脂质体肺靶向效果优于乳剂。
       关键词：酰化磷脂；鱼腥草挥发油脂质体；肺靶向；抑菌圈实验；气质联用
       Preparation of Nano Volatile Oil of Houttuynia cordata Thunb. Liposome and Lung Targeting Effect
       LUO Hujie, LI Linsheng*
       (Applied Chemistry Research Institute of Shanxi University of Science & Technology, Xianyang, Shanxi 712081, China)
       Abstract:ObjectiveThe lung targeting effect of the volatile oil of Houttuymia cordata Thunb. liposome was studied.MethodsThe nano volatile oil of Houttuymia cordata Thunb. liposome was made of acylated phosphatide with succinic anhydride and prepared by reverse phase evapoation and agitating-ultrasonic dispersion, the entrapment ratio of liposome was studied by Sephadex-G25 chromatography, and the appearance of liposome was observed by micrography, through tail intravenous injection, the small white mice were given the emulsion and the nano liposome, and the mice were killed after 0.5 h, the lungs were taken out and triturated, the drugs in lungs could be abstracted by solvent and the drug concentrations could be compared by GC/MS and a series of bactericidal tests.ResultsThe entrapment ratio of liposome was 94.77%, the volatile oil of houttuymia cordata Thunb. liposome has two layers, the average size was 97 nm, in abstracting liquor, with the liposome, 2-undecanone could not be found and the quality points of 9,12-octadecadienoic acid ethyl ester was 0.259%, but with the emulsion,2-undecanone and 9,12-octadecadienoic acid ethyl ester were both not be found, in bactericidal tests and with abstracting liquor, after given the liposome, the diameter of the bactericidal circles could get to 1.2 mm, however, after given the emulsion, the diameter of the biggist bactericidal circle was only 0.5 mm.ConclusionThe nano volatile oil of houttuymia cordata thunb liposome made of acylated phosphatide with succinic anhydride and prepared by reverse phase evapoation and agitating-ultrasonic dispersion was better than the emulsion in lung targeting.
       Key words:Acylated phosphatide; The volatile oil of Houttuymia corata Thunb. liposome; Lung targeting; Bactericidal test;GC/MS
                                                                        
　　鱼腥草挥发油有抗菌、抗病毒、消炎、解热的作用，广泛地运用于临床，常用于治疗肺部疾病，疗效确切。脂质体作为药物载体可提高药物的疗效和降低其毒副作用，并可达到缓控释和靶向给药目的［1，2］，而酰化磷脂制备的脂质体的稳定性更佳。为了解鱼腥草挥发油酰化磷脂脂质体体内给药的特点，采用气质联用和抑菌圈法比较了解鱼腥草挥发油脂质体与乳剂体内给药肺部靶向的效果。
       　　1  实验材料
       1.1 菌种与实验动物
       金黄色葡萄球菌为陕西科技大学生命科学与工程学院微生物实验室提供；小鼠购于咸阳动物供应站，并在实验前10 d以馒头和水喂食。
       1.2 主要试剂及仪器
       干品鱼腥草(购于咸阳民生大药房，自制鱼腥草挥发油)，酰化大豆磷脂（丁二酸酐酰化，自制），葡聚糖凝胶G25（上海化学试剂采购供应站分装厂，Pharmacia进口分装），span80为化学纯，牛肉浸膏和琼脂为生化试剂，其余试剂均为分析纯。
       电子分析天平（北京赛多利斯公司），781型磁力加热搅拌器（浙江乐清乐成电器厂），多频声化学发生器（成都市九洲机电工程研究所），FLUKO均化器FA25（上海弗鲁克流体机械制造有限公司），R205旋转蒸发器（上海申生科技有限公司），SHBⅢ(A)型循环水多用真空泵（河南省太康科教仪器厂），722S可见分光光度计（上海校光技术有限公司），800离心机（常州国华电器有限公司），H600透射电子显微镜（日本日立公司），九阳料理机JYL350（山东九阳小家电有限公司），气质联用仪（GC型号6890，MS型号5973，美国安捷伦公司）。
       　　2 实验方法
       2.1 鱼腥草挥发油脂质体制备方法［3，4］采用逆相蒸发－搅拌超声法制备脂质体：将鱼腥草挥发油、磷脂、胆固醇和非离子表面活性剂按一定比例溶于乙醚，加入一定体积的蒸馏水，冰水浴中在超声作用下进行搅拌，形成稳定的W/O型乳剂，常温下先在真空度小的情况下旋转减压蒸发再在真空度高的情况下旋转减压蒸发，形成水性悬液，用氮气短时吹拂，再加入一定体积蒸馏水，最后冰水浴中短时搅拌超声即得。
       2.2 鱼腥草挥发油乳剂的的制备［3］ 取少量乙醚溶解磷脂和鱼腥草挥发油，加入蒸馏水，冰水浴中10 000 r/min均化1 min，旋转真空减压，氮气短时吹拂至无乙醚味，再冰水浴中10 000 r/min均化2 min即得。
       2.3 鱼腥草挥发油脂质体包封率的检测［4］在用空白脂质体已饱和的Sephadex G25柱（1.1 cm×28.0 cm）上，移入1.00 ml制得的鱼腥草挥发油脂质体，以0.8 ml/min水合介质洗脱，弃去前4 ml洗脱液，收集紧接着的32 ml洗脱液，吸取7.5 ml洗脱液于50 ml容量瓶中，加入部分无水乙醇充分混合后再加无水乙醇至刻度，过滤，弃去初滤液，取后续液在415 nm处测定吸光度，换算成质量分数，并计算包封率：包封率＝包封于脂质体的药质量（g）／药物投料质量（g）×100％。
       2.4 鱼腥草挥发油脂质体稳定性的检测把脂质体乳液常温下放置10d后观察是否有沉淀出现。
       2.5 鱼腥草挥发油脂质体的显微形态观察用电子显微镜观察的方法将原液滴到铜网上5 min后，用滤纸吸去上面的多余液体，然后在向铜网滴上1％的磷钨酸染色2 min，吸干多余液体后在H600透射电子显微镜下观察拍照。
       2.6 体内给药［5，6］选取体重为20～22 g的健康小鼠6只，分3组，每组2只。每只小鼠由尾静脉注入鱼腥草挥发油脂质体0.5 ml，0.5 h后剖杀，取肺脏置捣碎器中，加入10 ml甲醇，1次/30 s，总共捣碎3次，制成均浆，2 500 r/min转速下离心15 min，取上清液。
鱼腥草挥发油乳剂（其药物浓度与脂质体一样）体内给药同上。
       2.7  抑菌圈实验
       2.7.1 取一定浓度的提取液于灭菌培养皿中。
       2.7.2 将直径为5mm的圆形滤纸片浸入培养皿中，而一组样品检测用四片滤纸片。
       2.7.3 将高层培养基融化保温在48℃的水浴中数分钟，用抹平棒将菌液在培养皿中抹匀（接入金黄色葡萄球菌0.1 ml）。
       2.7.4 抹匀后，用玻璃蜡笔在皿底背面标号。
       2.7.5 用无菌镊子夹取浸有试样的滤纸片在皿壁上碰刮去多余的溶液，平铺于编号对应的含菌培养基上（不同样品应换镊子）
       2.7.6 置于28℃的温箱中培养1 d，记录抑菌圈的大小，按2次实验平均值计算抑菌圈直径。
       2.8 气质联用分析［7］气相色谱条件：载气氦气0.8 ml/min ；分流比20∶1；色谱柱HP-1(30 m×0.25 mm)；进样口280 ℃；柱温程序：从60 ℃开始升温，5 ℃/min保温3 min，至265 ℃后则保温10 min。
质谱测定条件：离子源EI 230 ℃；电子能量70 eV；四极杆150 ℃；质量扫描范围15～500。
取肺部提取液1 ml加入9 ml食盐水充分混合，2 500 r/min转速下离心20 min，取清液再用氯仿萃取，静置分层，分液定容为25 ml，再取样进行气质联用分析。
       　　3  结果与分析
       3.1 鱼腥草挥发油脂质体性能测定结果酰化磷脂制备的鱼腥草挥发油脂质体包封率为94.77％，脂质体乳液常温下放置10d未见沉淀。
       3.2 鱼腥草挥发油脂质体微观形态由鱼腥草挥发油脂质体透射电镜照片（图1）可以看出酰化改性磷脂包封的鱼腥草挥发油脂质体为粒径均匀的球状或近球状的小单层脂质体，双层膜结构清楚，其平均粒径为97 nm。
       3.3抑菌圈实验结果见表1。表1  两种鱼腥草挥发油给药肺部提取液的抑菌效果比较（略）                                                                                    
　　由表1可以看出，通过尾静脉注射体内给药后，鱼腥草挥发油脂质体组的小白鼠肺部提取液抑菌效果好于乳剂组，其抑菌圈大小是乳剂组大小的两倍以上。但抑菌圈偏小，这与鱼腥草挥发油加入量小、挥发油中抑菌成分损失、注射量小、多级稀释等因素有关。另外在抑菌实验过程中，甲醇的挥发也会带走部分挥发油成分。
       3.4  气质联用分析结果鱼腥草挥发油中甲基正壬酮的质量分数仅为4.424％，而亚油酸的质量分数32.515％。体内给药后，脂质体组和乳剂组肺部提取液中均没发现甲基正壬酮，但脂质体组中发现有质量分数为0.259％的亚油酸乙酯，是可以理解的。这可能与肺部提取液中挥发油含量微少，而又加盐水、加氯仿萃取处理时进一步导致甲基正壬酮的损失有关。而亚油酸乙酯可能来自于亚油酸的衍变。结合抑菌实验结果，可以推测脂质体组应当比乳剂组更能提高鱼腥草挥发油在肺部的浓度。
        
                                              
　　4 结论
       本研究在冰水浴中采用逆相蒸发－搅拌探头超声法有利于制得稳定的鱼腥草挥发油纳米脂质体。
       据抑菌圈实验和气质联用分析结果，可以推测该法制备的鱼腥草挥发油酰化磷脂纳米质体相对于鱼腥草挥发油酰化磷脂乳剂能较好提高肺部靶向的效果。这符合脂质体形式的药物用于iv给药可使药物的肺沉积量剧增［2］。
       　参考文献：
       ［1］Deol P，Khuller G K，Joshi K. Therapeutic efficacies of isoniazid and rifampin encapsulated in lung-specific stealth liposomes against mycobacterium tuberculosis infection induced in mice［J］. Antimicrob Agents Chemother，1997，41(6)：1211.
       ［2］Zeng X M，Martin G P， Marriott C. The controlled delivery of drugs to the lung［J］. International Journal Pharmaceutical，1995，124：149.
       ［3］朱盛山.药物新剂型［M］.北京：化学工业出版社，2003：428.
       ［4］常桂民，段芳龄，杨淑英，等.脂质体阿霉素的制备及包封率测定方法的研究［J］.中国医院药学杂志，1999，19（6）：328.
       ［5］顾觉奋，王鲁燕，张俊琪.阿米卡星脂质体在小鼠体内的组织分布［J］.中国抗生素杂志，1998，23（4）：294.
       ［6］陈伟，韩文瑜，雷连成，等.肺靶向利福平脂质体在小鼠体内的分布及抑杀菌效果观察［J］.中国兽医学报，2003，23（2）：185.
       ［7］曾虹燕，蒋丽娟，张英超.鱼腥草挥发油的化学成分［J］.植物资源与环境学报，2003，12（3）：50.
       作者简介：罗琥捷(1979)，男(汉族)，广东湛江人，现在读陕西科技大学化学与化工学院硕士研究生，主要从事中药新剂型研究工作.
       通讯作者简介：李临生(1941)，男(汉族)，山东人，现任陕西科技大学教授，主要从事化学教学和科学研究工作.
       (陕西科技大学应用化学研究所，陕西 咸阳712081)
       收稿日期：20050331；