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       【关键词】  祖卡木颗粒
       摘要：目的优选出祖卡木颗粒剂的除杂工艺。方法以总黄酮、总蒽醌、甘草酸的保留率及固形物减少率为考察指标比较不同除杂工艺―超滤法、吸附澄清法、高速离心法、醇沉法及自然沉降法的效果。结果采用高速离心法进行除杂，有效成分保留最多。结论在对比的几种除杂方法中，采用高速离心法有效成分保留最多，而且操作简单，省时。
       关键词：祖卡木颗粒剂；超滤法；吸附澄清法；高速离心法；醇沉法
       Studies on the Purification Technology of Zukamu Granules
       XU Fang1, HUANG Yi, YAN Ming, MA Jianling, WANG Xintang, ZHONG Jie
       (1.Xinjiang Institute of Materia Medica，Urumqi  830002, China； 2.Medical College of Shihezi University，Shihezi, Xinjiang  832000, China)
       Abstract:ObjectiveTo select the optimum purified technology of Zukamu granules.MethodsThe purification conditions were optimized by content determination of total flavones，total anthraquinone，glycyrrhizic acid and the yield of dried extract comparing ultrafiltration method with absorbingclarifying method，ultracentrifugation method and alcoholprecipitation method. ResultsAll figures treated by ultracentrifugation method were the highest among the purified technologies.ConclusionThe ultracentrifugation method is the best because of high contentpreserved，simple operation and saving time.
       Key words: Zukamu Granules；Ultrafiltration method；Absorbingclarifying method；Ultracentrifugation method； Alcoholprecipitation method
       祖卡木颗粒剂是由山萘、睡莲花、大枣、大黄、甘草等药材提取制成，具有调节异常气质、清热、发汗、通窍之功效，用于感冒咳嗽、发热无汗、咽喉肿痛、鼻塞流涕等病症，疗效显著［1］。由于本品原工艺采用醇沉法除杂，需耗费大量乙醇和时间，为降低成本，需要寻找一个操作简便、成本小、省时的除杂方法，同时又能保证药物疗效。本研究比较了超滤法、吸附澄清法、高速离心法、醇沉法、自然沉降法等几种除杂方法的效果，优选出了祖卡木颗粒剂最佳的除杂方法。
       　　1 仪器与材料
       1.1仪器 UF80实验型膜分离(超滤)装置，中空纤维膜组件(分子量截流值分别为1万、3万、5万，膜材均为聚砜，天津膜天膜工程技术有限公司)；GQ76高速管式分离机(上海市离心机械研究所)；岛津LC10ATvp高效液相色谱仪，SPD10Avp紫外可见检测器，CLASSvp6.0数据工作站(日本岛津)；UV2501PC紫外可见分光光度计(日本岛津)； BS110S型电子天平(德国Sartorius)。
       1.2 材料
       药材由新疆维吾尔药业有限责任公司提供；芦丁、甘草酸单胺盐、1，8二羟基蒽醌对照品均由中国药品生物制品检定所提供；壳聚糖由华东理工大学理学院华凯科技贸易公司提供；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
       　　2 方法与结果
       2.1 考察指标的确定［2］除杂目的是降低出膏率，即增加固形物减少率，并且最大程度地保留有效成分，所以将固形物减少率作为考察指标之一，权重系数定为0.1。因为本制剂为抗感冒制剂，处方中多数药材都含有黄酮类成分，而黄酮类成分具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用，故将其成分保留率作为考察指标，权重系数定为0.6；大黄为方中主药之一，含蒽醌类衍生物，具有抗菌、抗病毒、抗炎作用，故将其成分保留率作为考察指标，权重系数定为0.2；甘草中所含的甘草酸具有抗炎、镇咳祛痰及免疫增强作用，故将其成分保留率作为考察指标，权重系数定为0.1。本研究用成分保留率来表示不同除杂工艺对总黄酮、总蒽醌、甘草酸含量的影响，计算公式如下：
       2.2考察指标的测定方法
       2.2.1  总黄酮的测定方法［3］采用分光光度法测定总黄酮，即芦丁对照品分别加5%亚硝酸钠、10%硝酸铝、4%氢氧化钠溶液显色，于510 nm波长处测定吸收值，得回归方程为：C(mg)=0.013 61+0.893 6A，r=0.999 8，在0.104 5～1.044 5 mg浓度范围内呈良好线性关系。精密量取一定量样品溶液，同法操作，在510 nm处测定吸收值，代入回归方程，计算含量。
       2.2.2 总蒽醌的测定方法［4］采用分光光度法测定总蒽醌，即1，8二羟基蒽醌对照品分别加0.5%醋酸镁甲醇溶液显色，于510 nm波长处测定吸收值，得回归方程为：C(μg)=-5.841 7+239.314 4 A，r=0.998 1，在47.232～283.392 μg浓度范围内呈良好线性关系。样品溶液加0.5 ml浓盐酸和30 ml氯仿，加热回流1 h，放冷，分取氯仿层，水层再用氯仿提取3次(20 ml/次)。合并氯仿层，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 ml容量瓶中，并用甲醇稀释至刻度。取此样品溶液同法操作，在510 nm处测定吸收值，代入回归方程，计算含量。
       2.2.3 甘草酸的测定方法［5］色谱条件： 色谱柱为Shimpack CLCODS柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈2%乙酸溶液(40∶60)；流速1 ml/min；检测波长254 nm；柱温30℃。
       标准曲线制备：取甘草酸单胺盐对照品约10 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取一定体积用甲醇配成系列浓度溶液。精密吸取各溶液10μl注入高效液相色谱仪，以甘草酸的峰面积A与甘草酸单胺盐的浓度C作直线回归，得回归方程为：C(μg/ml)=-5.952 4+1.397 0×10-4A，r=0.999 2，在13.52～270.40 μg/ml浓度范围内呈良好线性关系。
       供试品溶液制备及测定：精密量取一定量的样品溶液置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置24 h，离心，取上清液用0.45μm滤膜过滤。取续滤液10μl注入高效液相色谱仪，将测得的峰面积代入回归方程，计算含量。
       阴性对照溶液的制备及测定：按处方比例，取除去甘草的其它药味，制成模拟空白样品。按前述方法操作，结果在甘草酸的出峰位置处无其它干扰。
       2.2.4 出膏率及固形物减少率测定［2］精密量取一定体积的样品溶液，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于真空干燥箱中减压干燥至恒重，在干燥器中冷却30 min，迅速称重，计算出膏率及固形物减少率。
       2.3  除杂工艺条件筛选
       2.3.1  提取液(原液)制备按处方比例称取薄荷、洋甘菊、山奈，加入10倍量水，蒸馏法提取挥发油6 h，蒸馏后的水溶液滤过，备用；其余甘草等七味，加14倍量水，煎煮3次，1 h/次，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至一定体积，即得。
       2.3.2 超滤法超滤是根据体系中分子大小和形状，通过膜孔的筛分作用，在分子水平上进行分离，起到分离、纯化、浓缩或脱盐作用。影响超滤的主要因素有分子量截流值和超滤体积［6，7］，实验采用单因素考察法对这两个因素进行研究。
       分子量截流值考查：量取一定体积的提取液，倒入储液罐中，连接超滤器进行超滤。控制一定的压力，至超滤液的体积是原体积的1.5倍时，停止超滤。测定滤液中的各指标，计算综合评分。结果见表1。表1 分子量截流值考查分子量截流值（略）
       由表1可以看出，经不同分子量截流值的膜超滤后的滤液，其固形物减少率差别不大，但是5万分子量截流值的膜可以保留更多的有效成分，故采用5万分子量截流值的膜进行超滤体积倍数考查。
       超滤体积倍数考查：用5万分子量截流值的膜进行超滤。控制一定的压力，至规定的超滤体积倍数，停止超滤。测定滤液中的各指标，计算综合评分。结果见表2。由表2可以看出，虽然3倍超滤体积可以保留更多的有效成分，但是需处理的液体量太大，使后续的浓缩干燥过程变得很困难，故在实际生产中不实用。表2  超滤体积倍数考查超滤体积（略）
                       
　　2.3.3 吸附澄清法近年来出现的吸附澄清工艺因其使用简便、成本低、有效成分损失少而越来越受到人们的重视。甲壳素类澄清剂资源丰富、制备简单、成本低、应用方便，而且对人体无毒，体内可生物降解。选用壳聚糖对提取液进行吸附澄清处理，影响吸附澄清效果的主要因素有壳聚糖的加入量和药液浓度［8］，实验采用单因素考察法对这两个因素进行研究。
       壳聚糖用量考查：称取一定量的壳聚糖，用1%醋酸溶液配成1%的壳聚糖溶液。量取一定体积的提取液数份，分别浓缩至1∶2(药材重量:浓缩液体积，单位为g/ml)，水浴加热至80℃，加入规定量的壳聚糖溶液，快速搅拌10 min，静置24 h，观察澄清效果并测定各指标。结果澄清效果都不明显，溶液均不澄清。具体数据见表3。表3 壳聚糖用量考查壳聚糖用量（略）    
  
　　由表3可以看出，不同壳聚糖用量对出膏率影响不大；在5%时可以保留更多的有效成分，故选择5%的用量进行药液浓度考查。
       药液浓度考查：量取一定体积的提取液数份，分别浓缩至规定量，水浴加热至80℃，加入5%的壳聚糖溶液，快速搅拌10 min，静置24 h，观察澄清效果并测定各指标。结果澄清效果都不明显，溶液均不澄清。具体数据见表4。表4  药液浓度考查药液浓度（略） 
       表4可以看出，不同的药液浓度出膏率变化不大，在1∶6时可以保留更多的有效成分，此药液浓度较适合壳聚糖的澄清处理。
       2.3.4 沉降法自然沉降法：量取一定体积的提取液置500 ml量筒中，静置48 h，取上清液测定各指标。结果见表5。表5 沉降法考查结果处理方法（略）
       高速离心法：量取一定体积的提取液，经高速管式分离机进行高速离心，转速为20 000 r/min。考察因素为离心次数，结果见表5。
 
　　由表5可以看出，自然沉降法和高速离心法的出膏率特别高，但是可以保留更多的有效成分，尤其是高速离心法对于总黄酮、总蒽醌和甘草酸的损失量很小。
       2.3.5  醇沉法 影响醇沉效果的主要因素有醇沉浓度和药液浓度［2］，本实验采用单因素考察法对这两个因素进行研究。
       醇沉浓度的考查：量取一定体积的提取液数份，分别浓缩至1∶2(g/ml)，加入规定量的乙醇，使醇沉浓度分别为40%，50%，60%，70%，80%，静置24 h，滤过，滤液浓缩至一定体积，测定各指标。结果见表6。表6 醇沉浓度考查醇沉浓度（略）    
       由表6可以看出，醇沉浓度在70%时可以保留较多的有效成分，故选择70%的醇沉浓度进行药液浓度考查。
       药液浓度考查：量取一定体积的提取液数份，分别浓缩至规定量，加入一定量乙醇，使醇沉浓度为70%，静置24 h，滤过，滤液浓缩至一定体积，测定各指标。结果见表7。表7 药液浓度考查药液浓度（略）                                                                                                               
　　由表7可以看出，药液浓度在1∶2与1∶3时都可以较大程度地降低出膏率，并且保留较多的有效成分。
       　　3  结果分析与讨论
       将各种除杂方法中优选出的工艺条件对各指标的影响综合列表。见表8。表8 优选出的各除杂工艺条件对各指标的影响 （略）  
                                               
　　超滤法制备的溶液十分澄清，特别适用于制备注射液和口服液，由于本制剂为固体制剂，超滤出的药液体积很大，使后续的浓缩干燥过程变得很困难，在实际生产中不实用；而且出膏率也较高，有效成分损失较大，其综合评分最低，这可能是由于本研究所用膜的材质―聚砜不适用于这几类成分。吸附澄清法制备的溶液不澄清，有效成分损失较小，出膏率也较高，综合评分处于第二位，且操作不如高速离心法简单。高速离心法制备的溶液不澄清，出膏率很高，有效成分损失很小，是保留有效成分的最好方法，综合评分最高，而且操作简单，省时。自然沉降法与高速离心法相比，出膏率相同，但有效成分保留率稍差一些，耗费时间较长，若工厂内温度较高，药液容易长霉。醇沉法的出膏率低，能够有效降低剂量，但是有效成分的保留率比高速离心法、吸附澄清法低很多；与其它除杂方法相比，醇沉的成本较高，需要用乙醇，还要回收乙醇，工序复杂。
       综上所述，采用高速离心法进行除杂，有效成分保留最多，而且操作简单，省时，所以本研究将除杂方法定为高速离心法。
       参考文献：
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       ［6］刘振丽，张秋海，欧兴长，等. 超滤及醇沉对金银花中绿原酸的影响［J］. 中成药，1996，18(2)：4.
       ［7］刘振丽，张玲，张秋海，等. 超滤和醇沉对艾可冲剂有效成分影响的对比实验［J］. 中草药，1998，29(7)：451.
       ［8］张彤，徐莲英，陶建生，等. 壳聚糖用于部分单味中药浸提液澄清效果的研究［J］. 中草药，1999，30(10)：744.
       作者简介：徐芳(1973)，女(汉族)，新疆乌鲁木齐人，现任新疆维吾尔自治区药物研究所助理研究员，硕士学位，主要从事中药、民族药新药开发研究工作.
　
　　(1.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐830002；2.石河子大学药学院，新疆 石河子832000)
       收稿日期：20050324