文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【关键词】  板蓝根
        摘要：目的研究板蓝根高极性部位（Ftp）与板蓝根F022部位协同抗内毒素作用。方法ELISA法检测内毒素刺激鼠腹腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）水平，内毒素致BCG增敏小鼠死亡实验。结果Ftp联合F022处理巨噬细胞，能显著抑制TNF-α和IL-6水平，效果优于单用F022组；Ftp联用F022显著延长BCG增敏小鼠受内毒素攻击后的存活时间。结论Ftp本身抗内毒素活性较弱，但与F022部位合用，可进一步增强F022部位的抗内毒素作用。
        关键词：板蓝根；  抗内毒素活性；  TNF-α；  IL-6
        Top-polar Fraction Developing Anti-endotoxin Activity of F022 from Radix Isatidis
        LIN Aihua1， LIU Yiming1， QIU Xiaohui1， LIU Yunhai2
        (1.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM, Guangzhou  510120, China; 2.Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan  430030, China)
        Abstract:ObjectiveTo study the anti-endotoxin synergistic effect of top-polar fraction (Ftp)and F022 from Radix Isatidis. MethodsThe production of TNF-α and IL-6 of murine peritoneal macrophages stimulated by LPS was measured by ELISA. The lethality of BCG-primed mice was induced by LPS.ResultsFtp and F022 was added simultaneously to macrophages culture 1h before addition of LPS, Production was remarkably inhibited. Ftpand F022 remarkably protected BCG-primed mice from LPS induced lethality.ConclusionThese results suggest that Ftp can develop the anti-endotoxin activity of F022  from Radix Isatidis.
Key words:Radis Isatidis；  Anti-endotoxin activity；  TNF-α；  IL-6
        板蓝根（Radix Isatidis）是十字科菘蓝属植物菘蓝Isatis zndigotica Fort.的干燥根，为清热解毒之常用中药，常和其他中药组成复方，广泛用于多种疾病如流感、乙脑、肝炎等。内毒素（endotoxin）是革兰阴性菌细胞壁的脂多糖成分，中医认为内毒素为“热毒、邪毒”的物质基础。早期研究发现，板蓝根具有抗内毒素活性［1］。我们在研究中找到板蓝根抗内毒素活性强的F022部位［2］，并从该部位中分离得到丁香酸等活性指标成分［3］。板蓝根中富含氨基酸、多糖等高极性物质，此类物质已证实具有免疫调节作用［4，5］，对板蓝根中含有该类物质高极性部位的抗内毒素活性以及对F022部位抗内毒素作用影响的研究却未见报道。为此，本文将板蓝根经不同极性溶剂梯度洗脱后得高极性Ftp部位，研究Ftp在板蓝根抗内毒素活性中的作用。
           1  材料与方法
        1.1  药品与试剂板蓝根，经我院药学部鉴定为十字花科植物菘蓝（Isatis indigotica Fort.）的干燥根。细菌内毒素(700EU/支，福建省药品检验所，5mg/支，Sigma公司产品)；卡介苗（BCG，50mg/支，上海生物制品研究所）；TNF-α和IL-6试剂盒（北京邦定泰克生物有限公司）；新生小牛血清（NBS，批号981128，沈阳安迪生物高科技公司）。RPMI-1640细胞培养液（GIBCO公司）；0.9%氯化钠注射液（NS，批号000429，连云港制药厂）；层析硅胶（100~200目，青岛海洋化工厂）；氯仿、甲醇、石油醚等均为分析纯。
        1.2  主要仪器1815TC型CO2培养箱，Shel-Lab公司产；MK3型酶标仪，Labsystem Dragon公司产。
        1.3  动物C57BL/6小鼠(♀，6～8周龄，体重17~19 g)，由同济医学院器官移植研究所提供。昆明种小鼠（♂，体重18~22g），由同济医学院实验动物中心提供，均为清洁级。
        1.4  Ftp、F022的提取Ftp提取板蓝根，粉碎，用石油醚回流提取3次，过滤，弃去滤液，残渣晾干；再依次用醋酸乙酯、氯仿提取；最后残渣用水提取3次，合并滤液，减压浓缩，得浸膏，收率为1.8%。F022的提取参见文献［2］。
        1.5  腹腔巨噬细胞的制备及培养按文献方法［6］：取C57BL/6小鼠，腹腔注射BCG 2mg/只，4 d后拉颈处死动物，在无菌条件下注入冰冷的RPMI-1640培养液5 ml（含80 U・ml-1青霉素，100 μg・ml-1链霉素，10 U・ml-1肝素），轻揉腹部数次，抽取腹腔液，离心，用无血清的RPMI-1640洗涤细胞2次，加入含10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液，调整细胞浓度为2×106个/ml，加入24孔培养板内，每孔1ml，置37℃,5% CO2培养箱内培养2 h后，用无血清的RPMI-1640洗去非粘附细胞，贴壁细胞即为巨噬细胞。
        1.6  TNF-α和IL-6的诱生将Ftp样品液（相当于生药2.5g・ml-1）、F022样品液（相当于生药2.5g・ml-1）、Ftp+F022样品液及RPMI-1640各1ml分别处理巨噬细胞1h后，再加入终浓度为50ng・ml-1的LPS分别培养6h和24h后，取上清液，于-20℃保存待测。
        1.7  TNF-α和IL-6的定量检测ELISA法测定各标准品和样品光密度值（OD）,以各标准品浓度对OD值作标准曲线。结果表明TNF-α和IL-6浓度在0.1～10 ng・ml-1范围内与OD值具有良好的线性关系。由标准曲线求算出待测样品的TNF-α和IL-6的含量，作统计学t检验。TNF-α抑制率=(对照组浓度-药物组浓度)/对照组浓度×100%。IL-6抑制率的计算方法同上。
        1.8  内毒素致BCG增敏小鼠死亡实验  每只小鼠按100 mg・kg-1iv给予BCG，10 d后，随机分为4组，每组20只，分别为模型对照组、Ftp（25 g   生药・ml-1）组、F022（25 g 生药・ml-1）组、Ftp（25 g 生药・ml-1）+ F022（25 g生药・ml-1）组。每20 g灌胃0.4 ml，1.5 h后，静脉给予LPS 4 mg・Kg-1，分别在3，5，10，24，36，48 h内观察小鼠死亡情况，与对照组作统计学χ2检验。
           2  结果
        2.1  Ftp对LPS处理巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的影响结果表明， Ftp抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6能力较弱；Ftp+F022处理方式能显著抑制TNF-α和IL-6的分泌，效果优于Ftp组和F022组。见表1。
        表1  Ftp、F022对LPS所致鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α（略）
        2.2  Ftp对LPS致BCG增敏小鼠死亡的保护作用对照组小鼠受LPS攻击后10 h出现死亡高峰，死亡率达70%。Ftp、F022均能延长BCG增敏小鼠受LPS攻击后存活时间，但Ftp部位不及F022部位的作用，两部位合用则显著提高该保护作用，延长生存时间。Ftp、F022、Ftp+F022组的BCG增敏小鼠受LPS攻击后死亡率分别为50%，25%，15%。见表2。
        表2  Ftp、F022对LPS所致BCG增敏小鼠死亡的保护作用  （略）
        3  讨论
        内毒素性疾病的防治研究是近十几年来国际医药学界研究最为活跃的领域之一。内毒素是内毒素性疾病的发病、加重或影响预后的主要病因之一，由其所致的败血症休克的发病率和高病死率长期以来一直是困扰医学界的重大难题。板蓝根分布广泛，廉价无毒，因此，从板蓝根中寻找能中和、破坏内毒素且自身毒性低的物质，对内毒素性疾病的防治具有重要的意义。近年来研究表明，中药多糖参与了细胞的各种生命活动的调节，如免疫细胞间信息的传递，是一种良好的免疫调节剂，中药多糖的免疫调节作用已作为多糖研究的-个热点。本文研究了板蓝根中含有多糖、氨基酸等高极性物质的Ftp部位的抗内毒素作用，结果发现，Ftp抑制TNF-α和IL-6分泌的能力较弱，但与F022联用可显著提高F022抑制巨噬细胞分泌炎性因子的能力。提示Ftp免疫调节作用与板蓝根抗内毒素活性密切相关。不同实验动物对内毒素的敏感性有很大的差异，小鼠为低敏感动物。有很多方法可增强小鼠对内毒素的敏感性，如切除肾上腺、免疫抑制、肝损伤、感染等。不同增敏方法还可用于探讨药物抗内毒素作用的机理，本实验采用BCG增敏，其作用机制通过刺激T细胞后活化巨噬细胞，激活的巨噬细胞的有丝分裂和代谢能力大大增强，对LPS的识别应激能力进一步提高［7］。BCG增敏小鼠受LPS刺激后机体能产生较高的TNF-α水平。过高的TNF-α是引起小鼠死亡的重要因素。本实验证明Ftp联合F022部位能显著延长BCG增敏小鼠受LPS攻击后的生存时间。我们在先前的研究中发现，板蓝根各部位以及一些活性单体的抗内毒素作用都不及总提取部位［8］。本次研究表明板蓝根抗内毒素活性是各有效成分及部位共同作用的结果，Ftp部位对板蓝根抗内毒素有协同增效作用。
           参考文献：
       ［1］  刘云海. 板蓝根注射液抗内毒素作用的实验研究［J］.中草药，1993,24(8):413.
［2］  林爱华，方淑贤，方建国.板蓝根F022部位抗内毒素活性研究［J］.中国中药杂志.2002,27(6):439.
［3］  刘云海，方建国，贡雪鹏. 板蓝根中丁香酸的抗内毒素作用［J］.中草药，2003，34（10）：926.
［4］  许益民，陆平成，王永珍，等.板蓝根多糖促进免疫功能的实验研究［J］.中西医结合，1991，11（6）：357.
［5］  胡兴昌，张慧绮. 板蓝根凝集素对小鼠胸腺淋巴细胞分裂作用的电镜观察［J］.上海师范大学学报(自然科学版) ， 2002，3l（1）：61.
［6］  Kobayashi S, Kawata T, Kimura A, et al. Suppression of murine endotoxin response by E5531, a novel synthetic lipid antagonist［J］. Antimicrob Angents Chemother, 1998, 42(11): 2824.
［7］  Vogel S.N, Moore R.N, Sipe J.D，et al. BCG-induced enhancement of endotoxin sensitivity in C3H/HeJ mice［J］. J Immunol,1980,124(10):2004.
［8］  刘云海，林爱华，丁水平，等.板蓝根氯仿提取物及其4组份抗内毒素作用比较［J］.中国医院药学杂志，2000，21（6）：326.
        (1.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州  510120；
2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉  430030)