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       【关键词】  民族
        摘要：目的实验旨在应用中药血清药理学研究方法，研究民族药余甘子对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，对小鼠S180腹水肿瘤细胞存活率的影响以及对小鼠腹腔巨噬细胞细胞活化作用的研究。方法余甘子采用鲜果榨汁经冷冻干燥冻干保存。小鼠随机分6组，其中时效关系研究2组，量效关系研究4组。按0.2 ml/10 g体重用余甘子溶液灌胃。灌胃后30～180 min内不同时相无菌取血，利用中药血清药理学方法对实验血清作时效关系研究及量效关系研究。结果与结论时效关系研究表明，用余甘子冻干粉溶液灌胃后30～180 min内不同时相含药血清对小鼠脾淋巴细胞具有活化作用，并在给药2 h时实验血清活化作用明显；量效关系研究表明，余甘子大剂量组实验血清对促进小鼠脾淋巴细胞增殖，促进小鼠腹腔巨噬细胞细胞活化作用以及小剂量组实验血清对小鼠S180腹水肿瘤细胞存活率的影响均具显著差异性。
        关键词：余甘子；  含药血清；  腹腔巨噬细胞；  淋巴细胞；  S180腹水肿瘤细胞；  免疫调节
        Study on the Immunoregulatory Effect of Phyuanthus Emblica in Mice
        LUO Chunli1， ZHANG Yongping2， QIU Dewen2， ZHENG Weifa3
        (1.Agricutural School of Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2.GuiYang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China； 3.Xuzhou Normal University, Xuzhou 221000, China)
        Abstract:ObjectiveThe experiment applies the traditional Chinese medicine Plasma Pharmacology. This experiment studies how Phyuanthus emblica Phyllanthus emblica, the traditional Chinese medicine，promotes the propagate of the spleen lymphocyte of small mice, how it influents the survival rate of the mouse S180 ascites tumor cell and how it activates the macrophage in the abdominal cavity.MethodsAdopt the fresh fruit juice of Phyuanthus emblica. Dry it and keep in freeze. The small mice are randomly divided in 6 groups. Among them, 2 groups are studied in time-efficacy relation, the other 4 are studied in quantity-efficacy relation. Infuse the solution of Phyuanthus emblica Phyllanthus emblica 0.2 ml per 10g weight into the stomach of the small mouse. Take the blood in sterile environments at different time after 30min but before 180min, then study the time-efficacy relation and the quantity-efficacy relation with the traditional Chinese medicine Plasma Pharmacology.Results and ConclusionThe study of time-efficacy relation expresses that after infusing the solution of Phyuanthus emblica Phyllanthus emblica, medicated serum in different time activates the spleen lymphocyte of small mice differently after the 30min but before 180min. During this period, on 2h the activation of the medicated serum is the most obvious. The quantity-efficacy relation research expresses that megadose promotes the propagate of the spleen lymphocyte of small mouse and activates the macrophage in the abdominal cavity more obviously. On the other hand, the small dosage influents the survival rate of the  mouse S180 ascites tumor cell more obviously.
        Key words:Phyuanthus emblica;   Drugcontaining sera;   Immunoregulation;   S180 ascites tumor cell;   Spleen lymphocyte
        余甘子为大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果实，余甘子首载于《南方草木状》（为晋朝嵇含所著，是世界上最早的一部地方植物志）。余甘子在本草中首载于唐・苏恭《新修本草》。作为民族药最早被记载的是西藏帝玛尔・丹增彭措著的《晶珠本草》。实验研究证实，余甘子具有抗氧化、抗致畸、防肿瘤、抗病原微生物、降压、抗爱滋病毒、降血糖及改善糖尿病并发症、补益及降脂减肥等作用。证明其在提高机体免疫力方面具有很好的调节作用。中药血清药理实验方法具有体外实验条件可控性强，药物效应易于检测，可深入揭示药物作用机理等优点，又能防止中药粗制剂本身理化性质对实验的干扰，还可反映出药物中可吸收部分的直接作用。体现了体外和体内实验较好的结合。实验采用较先进的血清药理学方法，用小鼠服药后的含药血清代替中药煎剂进行体外实验，对脾脏淋巴细胞增殖活性、对小鼠腹腔巨噬细胞细胞活化作用以及对小鼠S180腹水肿瘤细胞存活率的影响进行免疫功能检测，通过时-效关系及量效关系对余甘子的药理作用及免疫调节作用机理作进一步阐明。
           1  材料
        1.1  试剂RPMI1640培养基（日本株式制药会社出品）；10%新生小牛血清（美国Sigma公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、刀豆蛋白-Ⅳ型（ConA-Ⅳ）、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；其余试剂均为分析纯。
        1.2  药品余甘子为鲜果榨汁的冷冻干燥粉。
        1.3  实验动物昆明种健康小鼠，雌雄各半，体重（26±2）g，由江苏省药用植物生物技术重点实验室动物房提供。
        1.4  实验仪器超净工作台；SHELATC2323型CO2孵育箱；日本产BIO-RED 550型酶标仪；96孔培养板；24孔培养板；数控恒温水浴箱；血球记数板（上海医用光学仪器厂 XB-K-25）。
           2  方法
        2.1  余甘子灌胃后不同时相含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用
   
    2.1.1  含药血清的制备参照文献［1］，小鼠用余甘子大剂量组（40.0 g鲜果/kg）灌胃，为成人日剂量的20倍。按0.2 ml/10 g体量灌胃给药，于给药后30，60，90，120，180 min分别用乙醚吸入麻醉，摘眼球无菌取血，37℃促凝，3 000 r/min离心10 min分离血清，血清呈透明、清亮、淡黄色、无沉淀、未溶血。56℃，30 min灭活（除去血清中的补体）。4℃保存备用（3 d之内有效）。
        2.1.2  正常小鼠对照血清的制备小鼠用蒸馏水0.2 ml/10 g体重灌胃，30 min后摘眼球取血，37℃促凝，3 000 r/min离心10 min分离血清，4℃保存备用（3 d之内有效）。
        2.1.3  脾淋巴细胞悬液制备参照文献［2］，正常小鼠脱颈椎处死，体积分数为0.75的酒精浸泡消毒，无菌取出脾脏，置盛有5～10 ml Hanks液平皿的100目铜网上，轻轻捻碎，使单个细胞经网进入Hanks液中，并移吸至刻度离心管中800 r/min离心10min，经Tris-NH4Cl除去红细胞，Hanks液洗3遍，镜下细胞记数，用RPMI1640培养液配成5×106/ml悬液。
        2.1.4  余甘子不同时相含药血清促进淋巴细胞增殖测定参照文献［3］，于96孔培养板中每孔加入100 μｌ脾淋巴细胞悬液，再加入100 μｌ，2 5 μg/ml ConA溶液及20 μｌ的实验血清，4复孔；20 μｌ空白血清，4复孔，37℃、体积分数为0.05的CO2培养48～72 ｈ。培养结束前4～6 ｈ每孔加入MTT溶液10 μl，培养结束弃去上清，每孔加入DMSO溶液200 μｌ，充分震荡后静置20 min，酶标仪测定A490 nm值。
        2.2  余甘子含药血清促进小鼠脾淋巴细胞增殖
        2.2.1  含药血清的制备参照文献［4］，小鼠随机分4组，每组6只，生理盐水组、余甘子大剂量组（40.0 g鲜果/kg）、余甘子中剂量组（20.0 g鲜果/kg）、余甘子小剂量组（10.0 g鲜果/kg）。按0.2 ml/10 g体重量灌胃给药，1次/d，连续给药7 d。于末次给药120 min后，摘眼球取血，37℃促凝，3 000 r/min离心10 min分离血清，血清呈透明、清亮、淡黄色、无沉淀、未溶血。56℃，30 min灭活（除去血清中的补体）。4℃保存备用（3 d之内有效）。
        2.2.2  正常小鼠对照血清的制备小鼠用蒸馏水0.2 ml/10 g体质量灌胃，30 min后摘眼球取血，37℃促凝，3 000 r/min离心10 min分离血清，4℃保存备用（3 d之内有效）。
        2.2.3  脾淋巴细胞悬液制备正常小鼠脱颈椎处死，75%酒精浸泡消毒，无菌取出脾脏，置盛有5～10 ml Hanks液平皿的100目铜网上，轻轻捻碎，使单个细胞经网进入Hanks液中，并移吸至刻度离心管中800 r/min离心10 min，经Tris-NH4Cl除去红细胞， Hanks液洗3遍，镜下细胞记数，用RPMI1640培养液配成5×106/ml悬液。
        2.2.4  余甘子含药血清促进小鼠脾淋巴细胞增殖测定于96孔培养板中每孔加入100 μｌ脾淋巴细胞悬液，再加入100 μｌ，2 5 μg/ml ConA溶液及20 μｌ的实验血清，4复孔；20 μｌ空白血清，4复孔，37℃、体积分数为0.05的CO2培养48～72 ｈ。培养结束前4～6 ｈ每孔加入MTT溶液10 μｌ，培养结束弃去上清，每孔加入DMSO溶液200 μｌ，充分震荡后静置20 min，酶标仪测定A490 nm值。
        2.3  余甘子含药血清对小鼠S180腹水肿瘤细胞存活率的影响
        2.3.1  含药血清的制备同上2.2.1。
        2.3.2  正常小鼠对照血清的制备同上2.2.2。
        2.3.3  S180腹水肿瘤细胞悬液的制备无菌条件下取S180腹水癌细胞，用基本1640液洗涤离心3次后，用完全1640液配成3×105个/ml备用。
        2.3.4  S180腹水肿瘤细胞存活率的测定于96孔培养板中每孔加入100 μl S180腹水癌细胞悬液，再加入100 μｌ，25 μg/ml ConA溶液及20 μl的试验血清，4复孔；20 μl空白血清，4复孔，37℃、体积分数为0.05的CO2培养48～72ｈ。培养结束前4～6ｈ每孔加入MTT溶液10 μｌ，培养结束弃去上清，每孔加入DMSO溶液200μｌ，充分震荡后静置20 min，酶标仪测定A490nm值。
        2.4  余甘子含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞的活化作用
        2.4.1  含药血清的制备同上2.2.1。
        2.4.2  正常小鼠对照血清的制备同上2.2.2。
        2.4.3  小鼠腹腔巨噬细胞分离参考文献［6］，小鼠腹腔注射质量分数为3%的巯基乙醇酸钠溶液2 ml，3 d后脱颈椎处死，腹部皮肤消毒处理，腹腔注射RPMI1640液8 ml，轻揉腹部60次，以使1640液充分洗腹腔，无菌取出腹腔液，1 000 r/min低速离心5 min，弃上清液，以RPMI1640液洗3次，调整细胞浓度为3.5×105/ml，4℃保存于完全RPMI1640培养液中备用。以上操作过程，细胞均置于0～4℃冰浴中。从杀死动物到将单个细胞悬液置入冰浴内的时间不宜超过30 min；而细胞悬液在冰浴中放置时间不宜超过3 h。
        2.4.4  巨噬细胞活性测定将巨噬细胞分装于96孔培养板中，每孔100 μl，分别加入含药血清20 μl，4复孔，空白血清20 μl，4复孔，轻轻震荡，37℃、体积分数为0.05的CO2孵育2 h，每孔加入MTT溶液10 μl，轻轻震荡，37℃、体积分数为0.05的CO2继续孵育2 h，取出，小心吸去上清液，每孔加入DMSO溶液200 μl，轻轻震荡，酶标仪测定A490 nm值。
        3  结果
        3.1  余甘子灌胃后不同时相含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的促进作用。与正常对照组比较，余甘子溶液40.0 g鲜果/kg体重灌胃，其(60～120)min等不同时相的含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖活性均具有促进作用（P＜0.01），而30 min，(150～180)min的含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖活性无明显促进作用（P＞0.05）。结果见表1。
        表1  不同时相余甘子含药血清对小鼠淋巴细胞增殖活性（略）
        3.2  余甘子含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖活性与正常对照组比较，余甘子溶液大、中、小3个剂量组灌胃，分别于末次给药120 min后摘眼球取血，含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖活性均具有促进作用。其中大、中剂量组含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖活性具明显促进作用（P＜0.01），小剂量组对小鼠脾淋巴细胞增殖活性促进作用不显著（P＞0.05）。结果见表2。
        表2  余甘子含药血清对小鼠淋巴细胞增殖活性（略）
        3.3  余甘子含药血清对小鼠S180腹水肿瘤细胞存活率的影响与正常对照组比较，余甘子溶液大、中、小3个剂量组灌胃，分别于末次给药120 min后摘眼球取血，含药血清对小鼠S180腹水肿瘤细胞存活率均具有抑制作用。其中小、中、大剂量组含药血清对小鼠S180腹水肿瘤细胞存活率具明显抑制作用（P＜0.01）。结果见表3。
        表3  余甘子含药血清对小鼠S180腹水肿瘤细胞的影响(略)
        3.4  余甘子含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞的活化作用与正常对照组比较，余甘子溶液大、中、小3个剂量组均具有一定促进作用。其中大剂量组具明显促进作用（P＜0.01），中、小剂量组对小鼠腹腔巨噬细胞细胞增殖活性促进作用不显著（P＞0.05）。结果见表4。
        表4  余甘子含药血清对小鼠腹腔巨噬细胞的活化作用(略)
           4  讨论
        本实验旨在应用中药血清药理学研究方法，研究民族药余甘子鲜果汁冷冻干燥粉促进小鼠脾淋巴细胞增殖，对小鼠S180腹水肿瘤细胞存活率的影响以及对小鼠腹腔巨噬细胞活化作用。在采用血清药理学方法进行实验前，进行余甘子时效关系研究是必要的，以便找出给药后的最佳采血时间，这样可以避免由于药物被代谢或尚未吸收造成的假阴性结果，理想的采血时间应在血药浓度的高峰期。由实验结果可以看出，余甘子对免疫功能的药效影响集中在服药后60～120，180 min后药效逐渐消失，这对临床用药可能有一定的指导意义。因此，首先通过考察时-效关系以确定余甘子含药血清的最佳采血时间，在此基础上进一步对余甘子免疫调节作用做量-效关系研究。采用中药血清药理学研究方法，中药粗制剂经口服吸收后，用含有药物成分的血清代替中药粗制剂进行体外实验则可排除中药粗制剂直接加入离体反应体系中各种影响因素的干扰，更接近药物在体内环境中产生药理效应的真实过程，使实验结果的可信度大大提高。另外，若能将血清药理学与血清药物化学有机的结合起来，将有助于中药药代动力学的研究和中药药效物质基础的阐明。余甘子为民族传统习用药材，贵州又为八大产区之一，野生资源丰富。余甘子药物制剂及保健品的开发，必将促进余甘子药材资源开发，也将推动贵州地方经济的发展。   
           参考文献：
       ［1］  梁春敏,王贤喜,董  群，等. 玉屏风散对小鼠免疫调节作用的血清药理学研究［J］. 上海免疫学杂志,2003,23(6):385.
［2］  董子明,张义国. 树突状细胞的特性和功能［J］.河南医学研究,1999,8（1）:77.
［3］  许化溪,刘龚植. 小鼠脾脏树突状细胞的分离与鉴定［J］.上海免疫学杂志,1991,11（3）:129.
［4］  王勇,王亚平,祝彼得. 人参总皂苷对小鼠造血细胞增殖的影响［J］.解剖学杂志,1995,18:153.
［5］  王力倩,余上才,李仪奎.用中药血清药理学的方法观察苦参、仙鹤草的抗肿瘤作用［J］.中国中医药科技1995，2(5) :19.
［6］  伍雪芳，梁春敏.玉屏风散对小鼠腹腔巨噬细胞活化作用的血清药理学研究［J］.基层中药杂志，2001，15（6）:11.
       (1.贵州大学农学院，贵州 贵阳  550025；  2.贵阳中医学院，贵州 贵阳  550002；
3.徐州师范大学，江苏 徐州  221000)