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       【关键词】  胶囊
        摘要：目的研究和络舒肝胶囊对小鼠日本血吸虫病肝纤维化的治疗作用及其机理, 并与吡喹酮的作用对比。方法80只小鼠随机分为4组。其中3组小鼠感染日本血吸虫8周后，分别以和络舒肝胶囊0.1粒/只/d治疗8周、吡喹酮500 mg・(kg・d)-1治疗2 d以及不作任何治疗(实验对照组)，第4组小鼠作为正常对照组。应用免疫组化染色及HE染色法，观察和分析和络舒肝胶囊及吡喹酮治疗前后各组小鼠肝组织病理改变及血小板衍生生长因-BB (platelet-derived growth factor, PDGF-BB)和Ⅰ，Ⅲ型胶原的表达变化。结果和络舒肝胶囊治疗后肝纤维化组织病理损伤减轻，PDGF-BB和Ⅰ，Ⅲ型胶原含量均明显低于实验对照组(P＜0.01)和吡喹酮组(P＜0.01或P＜0.05)。结论和络舒肝胶囊对小鼠日本血吸虫肝纤维化具有较好的治疗作用，其远期抗肝纤维化效果优于吡喹酮。　　
        关键词：和络舒肝胶囊；  日本血吸虫病；  肝纤维化；  血小板衍生生长因-BB；  胶原
        Therapeutical Effects and Mechanisms of Heluoshugan Capsule on Schistosome-infected Mice with Liver Fibrosis
        XU Biao
        (Department of Infectious Diseases, Puai Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Techology, Wuhan 430033,China)
        Abstract:ObjectiveTo study the therapeutical effects and mechanisms of Heluoshugan capsule on schistosome-infected mice with liver fibrosis. Compare the effects with praziquantel.MethodsEighty mice were divided into four groups: three groups were infected with Schistosoma japonicum. After eight weeks, one group was treated with Heluoshugan capsule 0.1capsule per mice every day for 8 weeks, one group was treated with praziquantel 500mg/(kg・d) for 2 days and the other was taken as experimental control without any treatment. The fourth group was taken as normal control. Immunohistochemical technology and HE staining were applied to observe the content of hepatic PDGF-BB，typeⅠ and type Ⅲ collagen in mice infected with S. japonicum before and after treatments.ResultsHeluoshugan capsule treatment significantly relieved pathologic damages in liver tissue with fibrosis, reduced the content of PDGF-BB, typeⅠ and type Ⅲ collagen compared to the experimental control (P<0.01) and the group treated with praziquantel (P<0.01or P<0.05). ConclusionHeluoshugan capsule has better therapeutical effects on Schistosome-infected mice with liver fibrosis and the effects surpass praziquantel in the long run.
        Key words:Heluoshugan capsule;  Schistosoma japonicum;  Liver fibrosis;  PDGF-BB;  Collagen
        日本血吸虫病的肝纤维化是导致门静脉高压、腹水和上消化道出血的主要原因,也是日本血吸虫病患者死亡的主要原因,目前国内外尚无理想的抗纤维化药物。文献报道, 和络舒肝胶囊有保护肝损伤及抗纤维化作用［1，2］,但未见其对血吸虫病肝纤维化作用的研究。本文研究和络舒肝胶囊对血吸虫病肝纤维化小鼠肝组织中血小板衍生生长因-BB (platelet-derived growth factor, PDGF-BB)和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量表达的影响, 观察肝组织病理变化，并与传统杀虫药吡喹酮的作用对比，以评估和探讨和络舒肝胶囊抗日本血吸虫病肝纤维化的作用及其机理。
           1  材料与方法
        1.1  实验药物和络舒肝胶囊由山东通化东宝药业股份有限公司生产,批号001001。主要成分由香附、鳖甲、虎杖、莪术等27种中药材组成。规格:每粒相当于总药材0.93g。使用前用生理盐水配制；吡喹酮粉末由同济医学院寄生虫教研室提供。
        1.2  小鼠血吸虫病肝纤维化模型的建立及动物分组雌性昆明小鼠80只,20～25 g,4～6周龄(购自同济医学院动物实验中心)。将小鼠随机均分4组,每组20只:①实验对照组：每只小鼠人工感染日本血吸虫尾蚴(购自武汉市血吸虫病防治研究所,下同)25条, 感染后以生理盐水灌胃8周，1 ml/(只・d); ②吡喹酮治疗组:感染尾蚴8周后用吡喹酮灌胃治疗2 d,剂量为500 mg・(kg・d)-1， 溶于生理盐水，1 ml/(只・d); ③和络舒肝胶囊组：感染尾蚴8周后用和络舒肝胶囊灌胃治疗8周,剂量为0.1粒/(只・d),溶于生理盐水，1 ml/(只・d)；④正常对照组：未感染血吸虫尾蚴，正常方法饲养16周。第16周末分别取各组小鼠肝组织作病理学检测和免疫组化分析。
        1.3  检测项目、试剂及方法
        1.3.1  肝组织切片HE染色光镜检查常规石蜡切片经HE染色后光镜下观察肝组织的病理变化。肝纤维化级别标准依病情轻重分3级,“+”为汇管区有轻度纤维组织增生,并向外伸展;“ ++”为较明显的纤维组织增生,并包绕肝小叶或与邻近汇管区纤维组织相互衔接;“++ ”肝组织纤维化;纤维组织沿门静脉分支高度增生,肝组织被挤压。
        1.3.2  PDGF-BB和Ⅰ，Ⅲ型胶原的免疫组化检测
        1.3.2.1  试剂兔抗小鼠PDGF-BB抗体(美国SANTACRUZ生产)、兔抗小鼠Ⅰ型及Ⅲ型胶原抗体、SABC试剂盒、包括正常山羊血清封闭液、生物素化山羊抗兔IgG、SABC试剂(链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物)、抗原修复液、复合消化液、DAB显色试剂盒等, 均购自武汉博士德生物工程有限公司。
        1.3.2.2  免疫组化染色方法采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法:3%H2O2室温10 min灭活内源性酶,蒸馏水洗2min×3次, 滴加复合消化液, 室温消化5 min, 0.01 mol/L PBS洗2 min×3次, 滴加正常山羊血清封闭液,室温孵育10 min, 甩去多余液体,分别滴加兔抗小鼠PDGF-BB兔抗小鼠 Ⅰ型和 Ⅲ型胶原,37℃孵育30 min,0.01 mol/L PBS洗2 min×3次, 滴加生物素化山羊抗兔IgG, 37℃孵育20 min,0.01 mol/L PBS洗2 min×3次, 滴加SABC试剂, 37℃孵育20 min,0.01 mol/L PBS洗5 min×4次, DAB显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗涤。脱水, 透明, 封片,显微镜下观察。
        1.4  结果分析免疫组化结果采用MPZAS-500多媒体彩色病理图文分析系统,计算平均积分光密度(integral light density, ILD), 以±s表示。两组间比较采用t检验。肝脏纤维化程度为等级资料，用Ridit分析。P<0.05表示有显著统计学差异，P<0.01表示有极显著统计学差异。
        2  结果
        2.1  肝组织普通病理变化光镜下, 正常对照组小鼠肝组织未见任何病变。实验对照组、吡喹酮组及和络舒肝胶囊组与正常组相比, 肝组织病理学观察发现众多慢性虫卵肉芽肿, 其虫卵周围包绕梭形细胞和胶原纤维,亦可见少部分急性虫卵肉芽肿,汇管区有大量炎性细胞浸润; 肉芽肿和小静脉周围的胶原纤维束向肝小叶周围延伸。但在病变程度和病变范围上, 吡喹酮组比实验对照组明显减轻(P<0.01)；和络舒肝胶囊组比实验对照组(P<0.01)、吡喹酮组(P<0.05)均明显减轻（见图1）。根据肝纤维化程度级别标准,统计每组小鼠各级别的鼠数(见表1)。
        2.2  肝组织中PDGF-BB表达的变化PDGF-BB棕黄色颗粒位于阳性细胞的胞浆内, 正常对照组PDGF-BB仅在门静脉血管内呈轻微表达, 实验对照组、吡喹酮组在汇管区、间隔内细胞、炎细胞、窦旁细胞内均有表达。和络舒肝胶囊组中PDGF-BB表达明显减少,主要见于血窦旁、汇管区,与实验对照组相比，PDGF-BB含量下降非常显著(P<0.01)；与吡喹酮组相比，PDGF-BB含量下降显著(P<0.01)；但其含量仍比正常组高(P<0.01)。 吡喹酮组肝组织中PDGF-BB含量比实验对照组有极显著下降(P<0.01)，但其含量仍比正常组高(P<0.01)。结果变化见表2，图2。
        图1  肝组织HE染色切片
        表1  小鼠肝脏纤维化程度组（略）
        表2  各治疗组与对照组肝组织（略）
        图2  各组小鼠肝组织中PDGF的表达(SABC×200)
        2.3  肝组织中Ⅰ，Ⅲ型胶原表达的变化正常对照组肝内无明显胶原着色。镜下见吡喹酮组、实验对照组肝内Ⅰ，Ⅲ型胶原呈棕黄色, 密集片状, 主要分布在虫卵肉芽肿内及汇管区。虫卵肉芽肿附近的叶间隔处亦有明显胶原着色, 呈条索状。治疗组肝内虫卵肉芽肿普遍较小,胶原分布较感染对照组减少，与实验对照组相比，Ⅰ，Ⅲ型胶原含量下降非常显著(P<0.01)；与吡喹酮组相比，其含量下降显著(P<0.05)；但其含量仍比正常组高(P<0.01)。吡喹酮组肝组织中Ⅰ，Ⅲ型胶原含量比实验对照组有显著下降(P<0.05)，但其含量仍比正常组高(P<0.01)。结果见表2及图
        图3  各组小鼠肝组织中Ⅰ型胶原的表达(SABC×200)
        图4  各组小鼠肝组织中Ⅲ型胶原的表达(SABC×200)
           3  讨论
        和络舒肝胶囊是一种纯中药复方制剂,其功能主要是疏肝理气, 清化湿热, 活血化瘀,滋养肝肾。临床上其被作为一种护肝药物,已广泛应用于慢性肝炎和早期肝硬化的治疗。近年来研究发现和络舒肝胶囊对硫代乙酰胺、CCl4造成急性肝损伤时ALT升高有抑制作用,并且能降低实验性CCl4肝损伤、肝纤维化模型中肝脏的胶原蛋白含量［3］。但和络舒肝胶囊对血吸虫病肝纤维化中的治疗作用却未见报道。血吸虫肝纤维化是在虫卵肉芽肿基础上产生的，其核心机制是在可溶性虫卵抗原刺激下，巨噬细胞与淋巴细胞产生PDGF、TGFβ1等各种细胞因子刺激肝星状细胞(HSC)活化、增殖、转化成肌成纤维细胞，并大量合成以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的ECM。因此抑制HSC活化、增殖成为抗肝纤维化治疗的重要对策。PDGF是Sis 原癌基因的表达产物，肝脏受损时，巨噬细胞、血小板、浸润的炎细胞、受损的内皮细胞及激活的HSC均可分泌 PDGF，以自分泌、旁分泌的方式发挥作用。PDGF被认为是刺激HSC增殖和相关信号传导最为有效的有丝分裂因子,对HSC的活化、分裂、增殖及其合成胶原等均有极明显的促进作用。PDGF分为AA、BB和AB 3个亚型, 以BB对HSC的作用最强［4］。本研究观察肝组织中的PDGF-BB含量变化，从而间接反映和络舒肝胶囊对HSC的抑制作用。目前认为肝窦毛细血管化是肝纤维化的最基本特征。电镜观察发现日本血吸虫尾蚴感染8周后，肝窦出现毛细血管化，而此时尚处于血吸虫肝纤维化病变的早期［5］。国内外肝病学者普遍认为［6］, 早期肝纤维化是可以逆转的,而肝硬化是不可逆转的。在血吸虫肝纤维化已形成的患者若早期应用抗纤维化治疗,可能有利于肝纤维化的逆转。本研究以日本血吸虫尾蚴感染小鼠8周后建立肝纤维化病变早期模型, 应用和络舒肝胶囊治疗血吸虫性肝纤维化，并同传统抗血吸虫药－吡喹酮进行作用对比。研究发现，经和络舒肝胶囊治疗后肝脏病理损伤减轻，肝组织中的PDGF和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量比实验对照组明显下降，但与正常组水平仍差异明显，表明和络舒肝胶囊对血吸虫肝纤维化有较好的逆转作用，但仍未恢复正常。吡喹酮治疗后肝脏病理损伤减轻，肝组织中的PDGF和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量比实验对照组亦明显下降，但仍未恢复正常水平；与和络舒肝胶囊治疗组相比，肝组织中的PDGF和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量仍较高。表明吡喹酮治疗日本血吸虫病肝纤维化能诱导明显的抗血吸虫性肝纤维化效应，但不能阻止肝纤维化的继续发展，其远期抗血吸虫肝纤维化作用不如和络舒肝胶囊明显。乌文琳等［7］亦发现吡喹酮一次性杀虫治疗后，血吸虫虫卵所致的肝纤维化仍可继续发展,其远期抗肝纤维化效果有限，抗肝纤维化的药物治疗很有必要。本研究认为, 和络舒肝胶囊可降低血吸虫病肝纤维化小鼠肝脏PDGF和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量而发挥抗血吸虫病肝纤维化作用,具有作用早、疗效持久的优势。和络舒肝胶囊作为一种纯中药制剂，毒副作用小，待抗血吸虫肝纤维化作用机理进一步明确后，其临床应用价值会更大。
           参考文献：
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［4］  贾皑, 苌新明, 张盈涛, 等. 螺内酯对实验大鼠肝组织TGFβ1、PDGF-BB及α-SMA表达的影响［J］.西安交通大学学报(医学版) 2004,25(1):64.
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       (华中科技大学同济医学院附属普爱医院，湖北 武汉  430033)