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       【关键词】  穿山龙总皂苷；,,T淋巴细胞增殖;,,白细胞介素
       摘要：目的用血清药理学方法研究穿山龙总皂苷对大鼠脾淋巴细胞增殖及其分泌IL2的影响，探讨其可能的作用机理。方法用MTT法测定不同浓度穿山龙含药血清（分别在培养系中加入20%，10%，5%含药血清）对Con A诱导脾淋巴细胞增殖的影响；用双抗体夹心ELISA法测定不同浓度穿山龙总苷含药血清对Con A诱导脾淋巴细胞分泌IL2影响。结果20%和10%穿山龙总皂苷含药血清可抑制Con A诱导的脾淋巴细胞增殖（P<0.01, P<0.05），20%和10%穿山龙总皂苷含药血清可抑制Con A诱导的脾淋巴细胞分泌IL2（P<0.01,P<0.05）。结论穿山龙总皂苷含药血清可抑制Con A诱导的大鼠脾淋巴细胞增殖及IL2的产生。
       关键词：穿山龙总皂苷；  T淋巴细胞增殖;  白细胞介素2；  血清药理学
       The Pharmacological Study of Whole Saponin of Rhizoma Dioscoeae Nipponicae Effect on Rats" T Lymph Cell Function
       YU Hairong， WANG Jixing，  ZHANG Fengying，   CHEN Jianshuang， SONG Hongru*
       （Chengde Medical College ,Hebei Chengde 067000, China; PLA NO.266 Hospital, Chengde, Hebei 067000, China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of whole saponin of Rhizoma Dioscoeae Nipponicae on rats`spleen lymph cell"s proliferation and its excreting IL2.MethodsBy MTT means, the way that the serum of different concentrations of whole saponin of RDN affect Con A"s stimulating spleen lymph cell`s proliferation were measured. By double-antibodies-ELLISA means, the ways that serum of different concentration of RDN act on Con A"s stimulating spleen lymph cell"s excreting IL2 were measured as well.ResultsThe serum of 20% and 10% whole saponin of RDN lowered Con A"s stimulating spleen lymph cell"s proliferation (P＜0.01,P＜0.05). The serum of 20% and that of 10% of whole saponin of RDN could lower Con A"s stimulating spleen lymph cell"s excreting IL2 (P＜0.01,P＜0.05).ConclusionThe serum of whole saponin of RDN can lower Con A"s stimulating the proliferation and excretion of IL2 of rats"spleen lymph cell.
       Key words：Whole saponin of Rhizoma Dioscoeae Nipponicae；  Tlymph cell proliferation；  Interleukin2；  Serum pharmacology
   
　　穿山龙又名穿地龙，野山药，为薯蓣科多年生藤本植物穿山龙薯蓣根茎。民间多用其浸酒或煎服，治疗风湿性关节炎、类风湿关节炎、过敏性皮炎等均有显著疗效。由于上述几种疾病发病机制与免疫功能紊乱有关，考虑其可能具有以免疫抑制为主的免疫调节作用。穿山龙总皂苷为其提取物，本实验研究也证实有良好的抗炎及免疫抑制作用，为进一步探讨其免疫抑制作用机理，本研究采用血清药理学方法，给大鼠灌服穿山龙总皂苷,采集其含药血清，加入到体外培养系中，观察穿山龙总皂苷含药血清对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖及其分泌IL2的影响。
       　　1  材料
       1.1  药品与试剂穿山龙总皂苷，由承德市宽城皂素厂提供，实验时用含0.01%吐温-80的生理盐水研成混悬液使用；泼尼松，新乡市太利药业有限公司，批号010806为纯品原料药，实验时用含0.01%吐温-80的生理盐水研成混悬液使用。青霉素、链霉素、刀豆蛋白A均为 Sigma公司产品。L-谷氨酰胺、RPMI1640为GIBCO公司产品。大鼠IL2试剂盒：美国BIOSOURCE公司产品。四甲基偶氮唑蓝（MTT）瑞士FIUKA公司产品。二甲基亚砜（DMSO），Na2HPO412H2O，KH2PO4，NaCl，KCl，MgSO4H2O, MgCl2，CaCl2等均为国产分析纯。
       1.2  动物健康成年Wistar大鼠，雌雄各半，体重160~180 g，由承德医学院动物室提供。
       　　2  方法
       2.1  含药血清的制备取Wistar大鼠30只，随机分成三组：穿山龙总皂苷实验组，泼尼松阳性药物对照组和溶媒对照组，分别灌胃给以穿山龙总苷1 000 mg（kg・d）、泼尼松9 mg （kg・d）和含0.01%吐温80的生理盐水2 ml，1次/d，连续7 d，末次给药后1 h，眶后取血，离心后取血清 ，将每组10只大鼠血清混合，经56℃水浴灭活30 min， 0.22 μm微孔滤膜除菌制得穿山龙含药血清，泼尼松含药血清、溶媒血清备用。
       2.2  脾淋巴细胞悬液制备另取Wistar大鼠6只,无菌取脾，将6只大鼠脾细胞混合,双蒸水破坏红细胞，制备脾淋巴细胞悬液。
       2.3  穿山龙总皂苷含药血清对ConA诱导的正常大鼠脾细胞增殖的影响（MTT法）穿山龙总皂苷含药血清设3个剂量组，分别为20%，10%，5%含药血清组，即在培养板每孔中加入穿山龙总皂苷含药血清分别为20%，10%，5%，每个浓度组分别设相应浓度的溶媒血清组和泼尼松含药血清对照。每组设6个复孔，每孔中加入3×106个/ml细胞悬液150 μl ，100 μg/ml的ConA 10 μl（终浓度为5 μg/ml）,20%，10%，5%血清组各加入相应大鼠含药或溶媒血清40，20，10 μl；每孔终体积不足200 μl的用RPMI1640补足。将培养板置5%的CO2培养箱饱和湿度37℃培养72 h。于培养结束前4 h，加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，置37℃5%CO2培养箱中继续培养4 h。取出培养板，每孔加入200 μl二甲基亚砜（DMSO），静置20 min，使紫色结晶呈完全溶解。取上清液150 μl于96孔培养板中，以无细胞悬液孔调零，570 nm处用酶标仪测OD值。
       2.4  穿山龙总皂苷含药血清对Con A诱导脾淋巴细胞分泌IL2的影响用24孔培养板，每孔加入3×106个/ml脾细胞悬液750 μl，100 μg/ml的ConA溶液50 μl（终浓度为5 μg/ml），20%，10%，5%血清组各加入相应含药血清或溶媒血清200，100，50 μl，不足1 ml的用RPMI1640补足，将培养板置37℃，5%CO2培养箱中，培养48 h后，离心，沉淀，取上清液，测定各孔IL2含量。
       2.5  统计学处理同一浓度的3种不同血清作用的比较、同种血清的3个不同浓度作用的比较均用F检验，若P<0.05，进一步做两两q检验。
       　　3  结果
       3.1  穿山龙总皂苷含药血清对ConA诱导正常大鼠脾细胞增殖的影响①20%，10%穿山龙总皂苷含药血清组可抑制ConA诱导的正常大鼠脾细胞增殖，5%穿山龙总皂苷含药血清组对ConA诱导的正常大鼠脾细胞增殖无显著抑制作用。②各剂量穿山龙总皂苷含药血清组与相应浓度的泼尼松含药血清相比较作用无显著差异（P>0.05）。③不同浓度的穿山龙总皂苷含药血清对ConA诱导的正常大鼠脾细胞增殖的抑制作用有剂量依赖性，各浓度组OD值关系为20%<10%<5% （P<0.05）。实验结果见表1。
       表1  穿山龙总皂苷含药血清对ConA诱导正常大鼠脾细胞增殖的影响（略）
       *与*相比较P<0.01，**与**相比较P<0.05，***与***相比较P>0.05
       3.2  穿山龙总皂苷含药血清对ConA诱导正常大鼠脾细胞产生IL2的影响①20%，10%穿山龙总皂苷含药血清组对ConA诱导正常大鼠脾细胞IL2有抑制作用。5%穿山龙总皂苷含药血清组对ConA诱导正常脾细胞产生IL2无抑制作用。②各剂量穿山龙总皂苷含药血清组与相应浓度的泼尼松含药血清相比较作用无显著差异P>0.05。③不同浓度的穿山龙总皂苷含药血清对ConA诱导正常大鼠脾细胞产生IL2的抑制作用有剂量依赖性，各浓度组IL2含量为20%<10%<5% （P<0.05）。结果见表2。
       　4  讨论
       血清药理学方法是指动物经口服给药后采集含药血清进行体外实验的一种方法。现已成为中药体外药效学研究的一种重要方法。它是在以前体外实验的基础上加以改进形成的，以中药血清代替中药粗提物进行体外实验，避免了中药直接体外用药的一系列干扰，不但能反映中药及其代谢产物的药理作用，而且能反映可能由药物诱导机体内源性成分所产生的作用,更接近药物在体内环境产生的真实过程。为从细胞分子水平研究中药药理学作用提供了新的手段。有关研究表明穿山龙总皂苷制剂皮下注射给药可抑制小鼠免疫功能［1］。口服穿山龙总皂甙可抑制小鼠绵羊红细胞溶血素抗体的生成，抑制小鼠二硝基氟苯所致迟发型超敏反应，说明其对体液免疫和细胞免疫均有抑制作用［2］。宋鸿儒等［3］发现其水煎剂体外给药可抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖。研究结果表明，穿山龙总皂苷含药血清可抑制大鼠T淋巴细胞增殖，且其作用有剂量依赖性；穿山龙总皂苷可通过抑制T淋巴细胞增殖抑制大鼠细胞免疫功能。与其水煎剂直接加入体外培养系的结果一致。考虑可能有药物中的成分通过肠道直接吸收产生一定的免疫抑制作用。
       表2  穿山龙总皂苷含药血清对ConA诱导正常大鼠脾细胞产生IL2的影响（略）
       *与 *相比P<0.01，**与**相比P<0.05，***与***相比P>0.05
       IL2，主要由活化的Th1细胞产生，在T细胞的活化、增殖、分化，Ｂ细胞分化、增殖和抗体生成及增强NK细胞活性的过程中均起到非常重要的作用。活化T细胞产生IL2能力的强弱可作为评价机体免疫功能的一项重要指标。IL2是T淋巴细胞增殖的关键免疫促进因子。本研究结果表明，穿山龙总皂苷含药血清可抑制由ConA诱导的大鼠脾细胞生成IL2的能力，对IL2产生的抑制可能是其抑制T淋巴细胞增殖、抑制大鼠细胞免疫功能的途径之一。中药免疫制剂以其作用耙点多、药理作用广泛、毒副作用小等特点备受重视。但我国目前有关中药免疫调节剂的研究主要集中在免疫增强方面，中药免疫抑制剂的研究相对较为薄弱，已经上市的仅有雷公藤制剂等少数几种。穿山龙总皂苷的免疫抑制及其毒副作用还需进一步研究，若能开发出以穿山龙总苷为原料的高效、低毒的免疫抑制中药制剂将有深远的意义。
       　　参考文献：
       ［1］  南景一.穿山龙水煎剂对小鼠免疫功能的抑制作用［J］.中草药，1988，19（3）：22.
       ［2］  高  巍，宋鸿儒，赵铁华，等.穿山龙总皂苷对小鼠免疫功能的影响［J］.承德医学院学报，2001，18（1）：9.
       ［3］  宋鸿儒.穿山龙总皂苷体外给药对T淋巴细胞增殖的抑制作用［J］.承德医学院学报，1998，15（3）：178.
       基金项目：河北省科技厅资助项目（No.12761181）
       (承德医学院，河北 承德  067000；  中国人民解放军第266医院，河北 承德  067000）