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       【关键词】  刺五加；,,高效液相色谱；,,指纹图谱
       摘要：目的采用高效液相色谱（HPLC）法建立了刺五加药材指纹图谱。方法色谱柱: Zorbax SBC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相∶乙腈水（梯度洗脱），检测波长：203 nm，柱温：40℃，流速：1.0 ml/min，分析时间：90 min。结果共标示出刺五加药材指纹图谱中24个共有峰。利用指纹图谱相似度测试软件，以夹角余旋为测度，测得10批刺五加药材指纹图谱相似度结果均在0.90～1.00之间。结论本实验所建立的刺五加药材指纹图谱分析方法准确、重复性好，为有效控制刺五加药材的质量提供了依据。
       关键词：刺五加；  高效液相色谱；  指纹图谱
       Studies on the Analysis Methods of Chromatographic Fingerprints of Acanthopanax senticosus Harms
       GAO Yang， ZHAO Yunli， BI Kaishun， YU Zhiguo*
 
　　(School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)
       Abstract：ObjectiveTo establish chromatographic fingerprint of Acanthopanax senticosus Harms by HPLC. MethodsSeparation was performed on an Agilent ZORBAX SBC18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) analytical column with mobile phase consisting of acetonitrile and water with gradient elute at the flow rate of 1.0 ml/min and the column temperature 40℃. The UV wavelength used for detection was set at 203 nm and the analysis time was 90 min.Results24 copeaks on the HPLC fingerprints of Acanthopanax senticosus Harms were indicated. The similarities were determined by cosine. The results of similarity analysis were 0.90～1.00. ConclusionThe method can be used for the quality control of Acanthopanax senticosus Harms.
       Key words：Acanthopanax senticosus Harms;  HPLC;  Chromatographic fingerprint
   
　　刺五加Acanthopanax senticosus Harms为五加科五加属植物刺五加的干燥根及根茎，具有益气健脾、补肾安神的功效。现代化学成分及药理实验表明［1，2］，刺五加总皂苷和刺五加多糖是其主要生物活性成分，具有抗癌、抗疲劳、抗肿瘤、免疫调节和解毒的药理活性。因此，建立刺五加药材有效的质量评价方法，不仅可确保刺五加药材质量稳定，还直接关系到刺五加相关的药品和临床处方的疗效。近年来，指纹图谱技术被用于中药的质量控制［3］，其优点在于可全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例，在大多数中药有效成分尚未阐明的现状下，仍可有效地表征中药质量。本文采用反相高效液相色谱法，建立刺五加药材指纹图谱，为刺五加的质量控制提供有效的方法。
       　　1  仪器与试药
       日本Shimadzu LC10AT高效液相色谱仪，SPD10AT紫外检测器，美国Suntek Science ANASTAR色谱工作站；电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；DL180超声波清洗仪（浙江省象山县石浦海天电子仪器厂）紫丁香苷（11574200201，中国药品生物制品检定所），刺五加药材均由贵州益制药股份有限公司刺五加药材GAP生产基地提供。乙腈为色谱纯，水为二次重蒸水，乙醇、甲醇均为分析纯。
       　　2  方法
       2.1   色谱条件色谱柱Zorbax SBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈水为流动相梯度洗脱，运行时间90 min，0 min时，乙腈为3%，0～20 min乙腈从3%变化到5%，20～30 min乙腈从5%变化到11%，30～90 min乙腈从11%变化到24%；柱温40℃；流速1.0 ml/min；检测波长203 nm；进样量20 ml。
       2.2  溶液的制备
       2.2.1  供试品溶液的制备 取刺五加药材约10 g，精密称定，加入100 ml水煎煮3次，2 h/次，滤过，合并滤液，旋转蒸发浓缩，加入95%乙醇使含醇量为75%，静置过夜，抽滤，滤液置旋转蒸发仪回收溶剂，残渣用水溶解并定量置5 ml量瓶中，摇匀，再用正丁醇萃取5次，5 ml/次，取正丁醇层，旋转蒸发回收溶剂，残渣中精密加入2 ml水溶解，过滤，0.45 mm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。
       2.2.2  对照品溶液的制备精密称取真空干燥的紫丁香苷对照品适量，加甲醇制成每毫升中含10.46 mg紫丁香苷的对照品溶液。
       2.3  测定方法精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20 ml，注入液相色谱仪，记录90 min的色谱图。
       2.3.1  精密度实验取No.3刺五加药材，按“样品溶液的制备”项下方法操作，在上述色谱条件下，连续进样5次，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致，RSD均小于3.0%，符合指纹图谱技术要求。
       2.3.2  重现性考察精密称取No.3刺五加药材5份，按“样品溶液的制备”项下方法操作，在上述色谱条件下进样分析，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致，RSD均小于3.0%，符合指纹图谱技术要求。
       2.3.3  稳定性考察精密称取No.3刺五加药材，按“样品溶液的制备”项下方法操作，在上述色谱条件下，分别在1，4，8，24，48 h进样分析，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致，RSD均小于3.0%，符合指纹图谱技术要求。
       　　3  结果
       3.1  刺五加药材HPLC指纹图谱中共有指纹峰的标定与技术参数的设定根据10批不同产地的刺五加供试品指纹图谱(见图1)的检测结果，总结出供试品指纹图谱中典型的24个色谱峰（见图2），其中9号峰为紫丁香苷的色谱峰，是刺五加的指标成分之一，将其作为内参比峰，各峰相对保留时间、相对峰面积结果见表1。
       图1  10批不同产地的刺五加供试品指纹图谱（略）
       图2  刺五加标准指纹图谱（略）
       3.2  刺五加药材指纹图谱相似度检验根据10个不同产地的刺五加药材的色谱指纹图谱建立共有模式，然后利用指纹图谱相似度计算软件，以夹角余弦作为测度，计算样品与共有模式之间的相似度。结果见表2。
       表1  刺五加相对保留时间，相对峰面积结果（略）
       表2  10批不同产地相似度计算结果（略）
       4  讨论    
　　
　　4.1  提取方法的考察刺五加药材中的有效成分分为水溶性和脂溶性两部分，本文采用HPLC法主要考察其水溶性成分，因此，对刺五加药材进行水提醇沉处理后，进行指纹图谱研究。
       4.2  参照物的选取现代化学成分及药理实验表明，刺五加总皂苷是刺五加主要生物活性成分之一，因此选定紫丁香苷作为参照物。
       4.3  色谱柱的选择分别采用Spherisorb ODS1柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特公司，含碳量为6%，不封尾），Dikma DiamonsilTM C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马公司，含碳量为17%，封尾），Batesil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特公司，含碳量为20%，封尾)，Zorbax SBC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent Technologies，含碳量为16%）进行洗脱，结果表明：Zorbax SBC18柱洗脱出的色谱峰基线平稳，峰数多且分离度好，所以，最终选用Zorbax SBC18色谱柱。
       4.4  流动相的选择本实验比较了不同比例甲醇水、乙腈水、甲醇乙腈水3种溶剂系统中加入不同种类调节剂进行等度洗脱，所得色谱峰分离度较差且峰数少；采用以上溶剂系统进行梯度洗脱时，以乙腈水溶剂系统所得图谱的峰形较好、分离度大，所以选用乙腈水系统为本实验流动相系统。本实验建立的刺五加药材HPLC指纹图谱相似度均在0.90~1.00之间，因此，在分析未知样品时，凡未知样品与标准样本间的相似度达到以上标准，其他项目均符合质量标准时，均可作为合格药材入药。
       　　参考文献：
       ［1］  肖培根. 人参、刺五加及其他具有适应原样作用的药物［J］.医学参考资料，1972，30 (7): 1972.
       ［2］  程秀娟. 刺五加对小鼠外周白血细胞系骨髓粒系组细胞集落形成的影响［J］. 癌症，1984，3 (3): 193.
       ［3］  谢培山. 中药色谱指纹图谱质量控制模式的研究和应用［J］.世界科学技术-中药现代化，2001, 3 (3): 18.
       ［4］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：272.
       ［5］  屠鹏飞. 中药指纹图谱指定的方法学探讨［C］. 现代中药产业关键技术系列研讨会（国际色谱指纹评价中药质量研讨会）.广州，2001.
       ［6］  任德权. 中药指纹图谱指控技术的意义与作用［J］.中药材，2001，24（4）:235.
       ［7］  国家药品监督管理局.中药注射液指纹图谱研究的技术要求（暂行）［J］.中成药，2000，20（10）：391.
       (沈阳药科大学药学院药物分析教研室，辽宁 沈阳   110016)