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       【关键词】  天年饮；,,衰老；,,睾丸；,,睾酮；,,超氧物歧化酶
       摘要：目的观察中药天年饮对衰老大鼠睾丸功能的影响。方法40只SD大鼠随机分为正常组、衰老模型组、天年饮用药组和阴性对照组，每组均为10只。采用D半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型。ELISA方法检测各组大鼠血清睾酮含量、黄嘌呤氧化酶法检测睾丸组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的活性、HE染色观察睾丸生精小管的形态结构。结果衰老大鼠血清睾酮含量、睾丸组织SOD活性明显下降（与正常大鼠相比较P<0.01）；衰老大鼠睾丸生精小管内生精细胞层数减少、细胞稀疏，生精小管管腔变狭窄。天年饮可明显抑制衰老大鼠血清睾酮含量和睾丸组织SOD活性的下降（用药组与模型组相比较P<0.01）；并能明显改善衰老大鼠睾丸生精小管的形态结构。结论 中药天年饮可明显改善衰老大鼠睾丸的功能，具有一定延缓衰老的作用。 
       关键词：天年饮；  衰老；  睾丸；  睾酮；  超氧物歧化酶
       Effects of Traditional Chinese Medicine Tiannianyin on Testis Functions of Aging Rats
       QIAO Yuebin, MA Xiuyan, ZHANG Songyan, XUE Jinfeng*
       (Basic Medical Institute, Chengde  Medical College, Chengde, Hebei 067000, China;Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde, Hebei 067000, China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of traditional Chinese medicine Tiannianyin on testis functions of aging rats. Methods40 SD rats were divided into 4 groups at random: normal group, aging model group, Tiannianyin group, negative control group, and each group had 10 rats. The sub-acutely aging model rats were made by injecting D-gal into abdominal cavity continuously. ELISA was used to detect the testosterone content in serum, xanthine oxidase method to detect the superoxide dismutase(SOD) activity in testis, HE staining to observe the morphology of seminiferous tubule. ResultsThe testosterone content in serum and the SOD activity in testis of aging rats decreased significantly compared with normal rats (P<0.01). The seminiferous tubule of aging rats appeared obviously morphological changes: the spermatogenic cells in seminiferous tubule reduced and arranged sparsely. Tiannianyin could inhibit the decreasing of testosterone content in serum and SOD activity in testis significantly (Tiannianyin group compared with aging model group: P<0.01), and significantly improve the morphology of seminiferous tubule.ConclusionTraditional Chinese medicine Tiannianyin can improve the testis functions of aging rats significantly, and has anti-aging effects.
       Key words：Tiannianyin;  Aging;  Testis;  Testosterone;  Superoxide dismutase
   
　　人类的衰老与性腺结构和功能的退化密切相关。随着年龄的增长，睾丸的结构和功能会出现一个由盛到衰的演变过程，发生精子生成能力减弱、血游离睾酮含量下降等变化。天年饮(由承德医学院中医系主任贾春华教授提供) 具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效。本实验采用D半乳糖致亚急性衰老的大鼠模型, 观察天年饮对模型大鼠睾丸功能的影响, 以期揭示天年饮延缓衰老的作用机理。
       　　1  材料与方法
       1.1  实验动物的选择及分组实验选用4 月龄雄性SD 大鼠40 只(由河北医科大学实验动物学部提供) , 体重180～250 g。将40 只大鼠随机分为4组：正常组、衰老模型组、天年饮用药组和阴性对照组, 每组均为10 只。其中模型组、用药组、阴性对照组均采用D半乳糖连续腹腔注射(200 mg/kg，1次/d, 共40 d) 制作亚急性衰老的大鼠模型。模型组大鼠于造模成功后不再作任何处理； 用药组大鼠于造模成功后每天用天年饮灌胃, 共30 d；阴性对照组大鼠在造模成功后每天灌胃同等剂量的生理盐水, 时间同用药组大鼠。
       1.2  中药的组成及用量天年饮由何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓6味中药组成, 经熬制后每毫升含生药1.5 g按8.1 g/kg灌胃。
       1.3  指标的检测
       1.3.1  血清睾酮含量的检测大鼠经内眦取血, 离心取上清，采用ELISA方法检测大鼠血清睾酮含量。
       1.3.2  睾丸组织SOD活性的检测断头处死大鼠，迅速取一侧睾丸，称重、匀浆后采用黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（SOD）的活性。
       1.3.3  睾丸生精小管形态结构的观察取大鼠另一侧睾丸，入Bouin液固定；常规石蜡包埋；Leica石蜡切片机连续切片，片厚5μm，每隔20张取蜡带贴于涂有蛋白甘油的载玻片上；常规HE染色，脱水、透明、封片，光镜下观察。
       1.4  统计处理 计数资料采用t检验进行统计分析。
       　　2  结果
       2.1  各组大鼠血清睾酮含量  见表1。由表1可见，与正常大鼠相比，衰老大鼠血清睾酮含量明显降低(P<0.01),天年饮灌胃可明显抑制衰老大鼠血清睾酮含量的下降, 用药组与模型组比较差异显著(P<0.01)。
       2.2  各组大鼠睾丸组织SOD的活性 见表1。 由表1可见，与正常大鼠相比，衰老大鼠睾丸组织SOD的活性明显降低(P<0.01)，天年饮可以明显抑制衰老大鼠睾丸组织SOD活性的下降，用药组与模型组比较差异显著(P<0. 01)。
       表1  大鼠血清睾酮含量及睾丸组织SOD的活性（略）
       与正常组比较，P<0. 01, **与模型组比较，P<0.01；n=10
       2.3  各组大鼠睾丸生精小管形态结构的变化 正常组睾丸生精小管界膜完整，无增厚及纤维化；基膜内可见排列整齐的各级生精细胞和支持细胞，管腔内可见精子。间质细胞的数目和形态无异常改变（图1）。模型大鼠睾丸生精小管形态结构发生明显变化，生精小管基膜部分增厚，变得不完整；基膜内生精细胞的排列还基本正常，但生精细胞层数减少，细胞稀疏，由于上皮突入管腔或各级生精细胞脱落，使管腔变狭窄。光镜下，支持细胞和间质细胞未见异常改变（图2）。用药组大鼠睾丸生精小管的形态结构较模型大鼠明显恢复，基膜趋于完整，生精细胞层数增多，但与正常大鼠睾丸相比，仍显生精细胞较稀疏（图3）。
       图1  正常大鼠睾丸生精小管（×200）（略）   
       图2  衰老大鼠睾丸生精小管（×200）（略）   
       图3  用药大鼠睾丸生精小管（×200）（略）
       　　3  讨论
       D-半乳糖致衰老模型是按照衰老的代谢学说建立的，表现出与人类自然衰老相似的一系列生理生化改变，其主要表现为免疫功能低下、基因表达与调控异常、细胞繁殖力下降及细胞退行性变等。产生这些变化的机理是半乳糖在体内代谢过程中可以产生过量的超氧阴离子自由基，从而引起过氧化效应，构成机体衰老的启动因素［1］。D-半乳糖致衰老模型在一定程度上体现了自然衰老的状态和机制，因此它是目前应用最多的衰老模型之一。睾酮的分泌受下丘脑―垂体的调节，在维持生精功能、刺激生殖器官的生长发育、促进蛋白质合成(特别是肌肉和生殖器官的蛋白质合成)方面起重要作用；它还参与神经-内分泌-免疫网络的调节，并且与三大物质代谢、抗氧化、各种应激反应等密切相关。有研究发现性类固醇激素能改变成年动物神经元的结构［2］、增加动物下丘脑视前区神经元树突的长度［3］；雄激素还可以减少线粒体质子漏而促进线粒体氧化偶联，亦可通过刺激基因表达调节线粒体内各种酶的活性，从而促进ATP的生成和利用［4］。Vermeulen等［5］报道衰老时下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)神经元减少，GnRH分泌量下降，同时垂体促性腺激素细胞的体积密度随年龄增加进行性下降并且对GnRH刺激反应性下降，在下丘脑、垂体衰老变化的共同作用下，老年男性Leydig细胞功能降低，使睾酮合成和分泌能力下降，导致老年人血清中睾酮水平降低［6］。由于线粒体呼吸耗氧量占机体总耗氧量的90%，所以线粒体是活性氧（ROS）的主要生成场所，线粒体在产生能量的同时生成ROS。在正常生理情况下，体内存在清除自由基的防御系统，它包括SOD、谷胱甘肽过氧化物酶等，还有一些抗氧化物质VE、VC等。由于这些酶类及抗氧化物质的存在，使体内ROS处于生成与消除的平衡状态，不会对机体造成损伤。随着年龄增长，这些抗氧化防御体系活性降低，清除自由基能力下降，使体内ROS生成过量，引起蛋白质结构疏松、核酸键断裂与多聚核糖体解聚等多种变化，导致衰老的发生［7］。研究表明，SOD活性下降与衰老有密切关系［8］，它的含量减少或活性降低被认为是衰老的一项重要指标。《素问・金匮真言论》有记载：“夫精者，身之本也”，并认为“天癸竭，精少，肾藏衰，形体皆极”是衰老的主要原因, 所以历代医家多用补肾为主的方药来延年益寿。中医学认为，肾为先天之本，肾藏精，其精气是构成人体和促进人体生长发育的基本物质。天年饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成。何首乌丸本由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝组成，能填精补髓、乌发延年。于此基础上加淫羊藿补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化淤以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神。诸药相配通调心脾肝肾四脏，而以肾为主。本研究发现，天年饮可明显提高衰老大鼠血清睾酮含量、睾丸组织SOD的活性，并可明显改善衰老大鼠生精小管的形态结构，说明天年饮可显著改善衰老大鼠睾丸的功能，具有良好的延缓性腺衰老的作用。
       　　参考文献：
       ［1］   Tamai KT, Gralla EB, Ellerby LM，et al. Yeast and mammalian metallothioneins functionally substitute for yeast copper-zinc superoxide dismutase ［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 1993，90:8013.
       ［2］  Motta PM. Ultrastructure of endocrine cell and tissue［M］.Boston: Martiuus Nijhoff Publishers, 1984,12.
       ［3］  Lu KH, Hopper BR, Vargo TM, et al. Chronological changes in sex steroid, gonadotropin and prolactin secretion in aging female rats displaying different reproductive state［J］.Biol Reprod, 1979,21(1):193.
       ［4］  Lukianora LD, Bobyleva V, Loschmava D, et al. The effect of various steroid hormones on Ca2+ transport and oxidative metobolism in isolated mitochondria［J］.Biull Eksp Biol Med, 1994, 118(12):616.
       ［5］  Vermeulen-A, Kaufman-JM. Ageing of the hypothalamopituitary-testicular axis in men［J］. Horm Res,1995,4(1-3)：25.
       ［6］  Chen H, Hardy MP, Hhtaniemi I, et al. Age-related decreased Leydig cell testosterone production in the brown Norway rat［J］.J Androl,1994,15(6):551.
       ［7］  Vohra BP, Sharma SP, Kansal VK. Age-dependent variations in mitochondrial and cytosolic antioxidant enzymes and lipid peroxidation in different regions of central nervous system of guinea pigs［J］. Indian J Biochem Biophys, 2001,38(5):321.
       ［8］  Inal ME, Kanbak G, Sunal E. Antioxidant enzyme activities and malondialdehyde levels related to aging［J］. Clin Chim Acta, 2001,305(1-2):75.
       基金项目：河北省科技厅资助项目（No.03547003D）
       (承德医学院基础医学研究所，河北 承德  067000；  承德医学院附属医院，河北 承德  067000)