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       【关键词】  多囊卵巢；,,动物模型；,,大鼠
       摘要：目的对孕激素联合HCG PCO动物模型进行评估。方法给24日龄雌性SD大鼠皮下埋植孕酮硅胶棒，2 d后再连续9 d皮下注射低剂量HCG，观察卵巢形态、血清激素含量及卵巢颗粒细胞凋亡、卵泡闭锁情况。结果模型组大鼠卵巢重量、体积增加，卵巢呈多囊性改变，卵泡颗粒细胞减少而膜细胞层增加，颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁增加，血清中孕酮、睾酮明显增高，而雌二醇变化不明显。结论此动物模型卵巢病理改变及血内分泌改变与PCOS病人相似，可以作为多囊卵巢研究的动物模型。
       关键词：多囊卵巢；  动物模型；  大鼠
       A Rat Model for Polycystic Ovary
       JIANG Shengfang, CAO Shufen, ZHANG Changjun
       ( Shiyan People"s Hospital, Shiyan, Hubei 442000,China)
       Abstract:ObjectiveTo evaluate the animal model for polycystic ovary (PCO).MethodsProgesterone-synchronized immature rat were injected 1.5 IU HCG twice-daily for 9 days. Ovarian morphology, serum hormone, apoptosis of granulose cells and atresia of follicles were observed.ResultsIn the model group the weight and volume of cysfic ovaries highly increased, granulose cells reduced and thecal cells increased.Apoptosis of granulose cells and atre sia of follicles increased. In addition, serum progesterore and festosterone increased highly.ConclusionThese results suggested that this kind model is suitable for the PCO research.
       Key words:Polycystic ovary(PCO);  Animal model;  Rat
   
　　多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome ,PCOS）是妇科常见的生殖功能障碍性疾病，主要表现为卵巢的雄激素过多所造成的闭经、多毛、肥胖及无排卵，其发生率占生育年龄妇女的5%～10%。建立多囊卵巢综合征动物模型对其病因的基础研究以及指导临床的诊断和治疗有深远的意义。多年来，高LH血症被认为是PCOS的主要内分泌变化和特征［1］。K.Bogovich等据此提出一种孕激素联合HCG的PCO动物研究模型［2］，本实验对此模型从内分泌、形态、卵巢颗粒细胞凋亡及卵细胞闭锁等方面进行研究，以对此模型进行评估。
       　　1  材料与方法
       1.1  试剂左旋18甲基炔诺酮硅胶棒：上海达华制药厂，购自十堰市计划生育服务站，每根含75 mg左旋18甲基炔诺酮；HCG（注射用）：北京高科，华泰制药，500IU/支；放免试剂盒：购自深圳拉尔文生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒：购自武汉博士德生物工程有限公司。
       1.2  动物模型的建立实验选用24日龄未成年雌性SD大鼠20只，随机分成对照组和模型组，每组10只。模型组皮下埋植左旋18甲基炔诺酮硅胶棒（3 mm），从27日龄开始每天2次皮下注射1.5IUHCG，共注射9 d至36日龄。对照组每天注射等量生理盐水。
       1.3  激素测定两组大鼠均于24日龄、36日龄分别称体重，36日龄断头处死，取血，3000 r/min离心20 min，收集血清样品，-20℃储存，按放免试盒说明书测血清中孕酮（P）、雌二醇（E2）、睾酮（T）含量。测定仪器：SN679型放射免疫γ计数仪。放免质控符合要求，批内变异系数＜10%，批间变异系数＜15%。
       1.4  卵巢形态学观察大鼠处死后立即取出双侧卵巢称重，分别测量卵巢长径（L）、短径（S），计算平均卵巢面积（MOP=L×S）、卵巢体积V=4.19×〔(L+S)/2〕3。用10%福尔马林固定作常规石蜡切片HE染色及TUNEL法检测颗粒细胞凋亡。观察两组大鼠双侧卵巢大体解剖及光镜(HE)染色及TUNEL改变，计算每张切片囊状卵泡数、囊状扩张卵泡比例，进行卵泡膜细胞层最大厚度及颗粒细胞层最大厚度的显微测量。光学显微镜镜下对凋亡染色进行观察，计算每张切片凋亡颗粒细胞数。根据李爱冬、羊惠君等的方法计算闭锁卵泡数，测量最大闭锁卵泡直径（测量卵泡中两个最大垂直直径，取平均值则为该卵泡直径）。
       1.5  数据处理计量资料以均值±标准差表示，组间差异的比较采用双侧t检验。记数资料采用χ2检验。
       　　2  结果
       2.1  大鼠体重差模型组造模前后体重显著大于对照组（见表2），P＜0.05。
       2.2  激素测定与对照组相比，模型组E2含量变化不明显，而P，T均显著升高。结果见表1。
       表1  两组大鼠血清激素水平比较（略）
       与对照组比较，△P＜0.05
       　　3  卵巢形态学观察
       3.1  卵巢大体解剖学改变对照组卵巢色泽红，模型组卵巢表面色泽苍白，体积增大，见较多囊状扩张的卵泡。模型组卵巢重量、体积、平均卵巢面积均显著高于对照组（见表2），P均＜0.01。
       表2  两组大鼠造模前后体重差及卵巢大体解剖比较（略）
       与对照组比较，△P＜0.05，★P＜0.01
       3.2  HE染色光学显微镜观察卵巢形态对照组卵巢镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，卵泡数明显高于模型组，模型组囊状扩张卵泡比例明显增加，囊状扩张卵泡内卵母细胞或放射冠消失，颗粒细胞层数减少，排列疏松，内外卵泡膜细胞层分层明显。模型组颗粒细胞层厚度较对照组明显变薄（P＜0.01），泡膜细胞层厚度较对照组明显增厚。见表3及图1~2。
       表3  两组大鼠卵巢形态学比较（略）
       与对照组比较,*P＜0.005,△P＜0.01，★P＜0.05
       图1  对照组卵巢镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，卵泡数明显高于模型组（×40） （略）
       图2模型组囊状扩张卵泡比例明显增加，囊状扩张卵泡内卵母细胞或放射冠消失，颗粒细胞层数减少，排列疏松，内外卵泡膜细胞层分层明显（×40）（略）
       3.3  凋亡颗粒细胞数凋亡阳性染色呈褐色细颗粒状，位于细胞核。阳性颗粒细胞的核浓缩，或靠边呈环状或呈新月形（图3）。模型组卵巢凋亡颗粒细胞数较对照组明显增加，差别具有显著性意义（P＜0.05）。结果见表4。
       3.4  卵泡闭锁情况生长卵泡内，其颗粒细胞较大，核圆，排列整齐。基膜和卵泡膜完整。无颗粒细胞被TUNEL法所标记（图4）。闭锁卵泡至少有5个以上的颗粒细胞被TUNEL法所标记（图5）。模型组闭锁卵泡数明显多于对照组，闭锁卵泡平均直径明显大于对照组差别有显著性意义（P＜0.05）。结果见表4。
       表4  两组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁情况比较（略）
       与对照组比较，★P＜0.05
       　　4  讨论
       由于多囊卵巢并非一种简单独特的疾病，而是一种多病因，临床表现多态性的综合征，病理生理变化涉及广泛，包括神经、内分泌及代谢系统和卵巢局部的调控因素，造成某个调节机制的不平衡而出现的各种反馈失常和连锁反应。因此，有学者认为没必要也不可能有一个“万能”的PCOS动物模型；动物模型的适合与否取决于所要研究的PCOS相关疾病［3］。
       图3（略） 
       图4（略）
       图5（略）
       目前国内外采用较多的各种多囊卵巢综合征动物模型建立的方法包括丙酸睾丸酮造模法、脱氢表雄酮造模法、雌激素造模法、孕激素联合HCG造模法、胰岛素联合HCG造模法。本文所选用的孕激素联合HCG造膜法由K・Bogovich［2］首先提出，其基本原理在于皮埋左旋18甲基炔诺酮可使E2，P，FSH，LH均呈现低水平，导致不排卵。而HCG的化学结构和生物作用与LH类似，在卵泡早期使用可致卵泡闭锁，且能够模拟PCOS持续升高的LH水平。目前尚无LH制品，故联合使用HCG以造成PCOS动物模型。本研究发现造模后大鼠血清T明显升高而E2变化不明显，卵巢体积、重量明显增加，囊性扩张的卵泡比例也明显增大，囊状卵泡内卵母细胞或放射冠消失，合成雌激素的颗粒细胞层次减少，而合成雄激素的卵泡内膜细胞明显增生，这些均与人PCOS血清激素水平变化及卵巢病理学改变相一致，亦说明多囊卵巢大鼠的高雄激素主要来源于卵巢。已有研究表明在卵泡发育过程中，颗粒细胞的增殖、分化起着重要的作用，颗粒细胞大量凋亡将会影响卵泡的正常发育成熟过程［4］，有文献报道［5］如果卵泡在发育时期颗粒细胞凋亡的话，即会导致卵泡闭锁。本实验结果显示造模后凋亡颗粒细胞数及闭锁卵泡数均明显增加，说明多囊卵巢大鼠存在卵巢发育障碍，可能由于注射HCG造成异常升高的LH促使卵巢卵泡内膜细胞及间质细胞合成过多雄激素，过高浓度的雄激素转化为不能芳香化的双氢睾酮，而且抑制FSH诱导的芳香化酶活性及颗粒细胞LH受体生成，抑制卵泡的发育，促进卵泡的闭锁。近来的研究表明，卵泡发育不同阶段颗粒细胞发生凋亡的敏感性不同［6］，因此，不同发育阶段卵泡的闭锁情况是不同的。与正常的卵巢相比，有更多数量卵泡的卵泡簇进入募集的窦卵泡而不闭锁，成为PCOS多个卵泡同时发育的基础［7］。本实验通过对闭锁卵泡直径的显微测量验证了以上观点，模型组闭锁卵泡平均直径明显大于对照组，提示多囊卵巢大鼠卵泡闭锁发生的时间推迟，有更多数量的窦卵泡发育而不闭锁，导致多个卵泡同时发育，而闭锁卵泡持续存在数月，形成大小不等的囊泡，最终导致多囊卵巢形成。综上所述，皮埋左旋18甲基炔诺酮联合HCG诱导SD幼年雌性大鼠PCOS动物模型卵巢病理改变及血内分泌改变与PCOS病人相似，并且从细胞水平提示了多囊卵巢综合征卵巢发育障碍的可能机制，是较理想的PCOS动物模型。
       　　参考文献：
       ［1］  姚元庆.多囊卵巢综合征的内分泌变化及临床意义［J］.中国实用妇科与产科杂志，2002，18（7）：391.
       ［2］  Bogovich K.Induction of ovarian cysts in progesterone synchronized immatrue rats:evidence that suppression of follicle aromatese activity is not aprerequisite for the induction of cystic follicles［J］.Endocrinology,1989,124(4)：1646.
       ［3］  Szukiewicz D,Vilenbroek JT.Polycystic ovary syndrome searching for an animal model［J］.J Med ,1998,29(5～6)：259.
       ［4］  Kim JM,Yoon YD,T sang BK.Involvement of the Fas/Fas ligand system in p53-mediated granulosa cell apoptosis during follicular development and atresia［J］.Endocrinology Philadelphia,1999,140：2307.
       ［5］  Matsuo H, Maruo T, Samoto T. Increase dexpression of Bcl-2 protein in human uterine leiomyomaand its up-regulationbyprogesterone［J］.JCLinendoerinoLMet ab,1997,82(1)：293.
       ［6］  姜  泊.细胞凋亡基础与临床［M］.北京：人民军医出版社，1999：248.
       ［7］  梁晓燕，庄广伦，周灿权.多囊卵巢综合征中卵巢初级小卵泡bc12、bax的表达［J］.生殖医学杂志，2001，10（2）：90.
       (湖北省十堰市人民医院生殖医学研究中心  442000)