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       【摘要】 
       目的对茅苍术多糖的提取、分离纯化和单糖的组成进行了分析。方法茅苍术经热水提取乙醇沉淀得多糖粗品(APW)，APW经脱蛋白、透析、DEAE-纤维素柱和Sephadex G-100柱层析进行纯化，纯化多糖通过色谱等方法进行分析。结果粗多糖主要含APW1，APW2，APW3，APW4四个组分。结论纯化多糖经高效凝胶色谱、薄层层析、气相色谱等分析得知：APW1分子量约为5.3×103，由Rha，Ara，Xyl，Man，Glu，Gal组成，其摩尔比为0.16：0.17：0.24：0.55：0.89：1.00；APW2分子量约为5.4×104，由Ara，Man，Gal组成，其摩尔比为0.82：1.00：0.32；APW3、APW4分子量约为7.0×105，2.0×106，均由Rha ，Ara，Man，Gal组成，其摩尔比分别为0.24：1.00：0.48：0.53及0.22：0.34：1.00：0.58；为茅苍术多糖的进一步研究提供了基础。
       【关键词】  茅苍术；多糖；分子量；组分
       
       Separation, Purification and Composition Analysis of Polysaccharides From Rhizomes of Atractylodes lancea (Thunb.)DC
       DUAN Guofeng，OUYANG Zhen ，YU Boyang
       1.Altitude Vocational School ,China Pharamaceutical University, Zhenjiang,Jiangsu 212003,China ;
       2.Biology and Environment School,Jiangsu University, Zhenjiang,Jiangsu 212013,China ;
       3.School of Chinese Materia Medica ,China Pharamaceutical University, Nanjing, 210038,China
       Abstract：ObjectiveTo purify and analyse the polysaccharides from rhizomes of Atractylodes lancea DC.MethodsThe  crude polysaccharides(APW) were obtained by extracting with hot water and precipitating with alcohol. The cleared APW were purified by DEAE-cellulose, Sephadex G-100 column, and it was analyzed by chromatography. ResultsThe purified four proteins (APW1～4) were removed from crude polysaccharides. ConclusionAnalsed by HPGC,TLC and GC, the  molecular weight of APW1～4 5.3×103 ,5.4×104,7.0×105 and 2.0×106,respectively. The chemical components and the molar ratio showed as follows:APW1：Rha∶Ara∶Xyl∶Man∶Glu∶Gal=0.16：0.17：0.24：0.55：0.89：1.00；APW2： Ara：Man：Gal =0.82：1.00：0.32. The component APW3 and APW4 were Rha, Ara, Man and Gal，the molar ratios showed 0.24：1.00：0.48：0.53 and 0.22：0.34：1.00：0.58. All these work can establish foundation for the further study of Atractylodes Polysaccharides.
       Key words：Rhizomes of Atractylodes lancea(Thunb.) DC；  Polysaccharides；  Molecular weight；  Component 
        中药茅苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes  lancea (Thunb.) DC. 的根茎。始载于《神农本草经》，列为上品，性温，味辛、苦，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目的功效，主要用于脘腹胀满、泄泻、水肿、脚气痿躄、风湿痹痛、风寒感冒、夜盲等症。主产于江苏句容、镇江、湖北襄阳、河南桐柏等地，江苏茅山地区是茅苍术地道药材的中心产区。关于茅苍术的研究，近年来主要集中在其挥发油等挥发性成分的化学及药理的研究［1～3］；对于茅苍术水溶性成分多糖的研究，仅见K.-W.YU等［4～6］对湖北产的茅苍术作了研究，研究表明茅苍术多糖具有肠免疫活性、抗假丝酵母菌感染等药理作用，活性与多糖中阿拉伯半乳糖及半乳糖醛酸性部位有关；而对传统地道药材江苏茅山地区茅苍术多糖的研究，国内外未见报道。
        本文报道了江苏茅山地区茅苍术多糖的提取纯化及组成研究，药材脱脂后经水提、醇沉，经DEAE-纤维素和Sephadex G-100柱层析得到APW1～4四个多糖组分，并经高效凝胶色谱、薄层色谱和气相色谱等分析确定茅苍术多糖的分子量及单糖组成，为进一步研究其化学结构和生物活性提供了依据。
       1  材料与仪器
       1.1  材料与试剂
       茅苍术采集于江苏句容茅山地区，经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为菊科植物茅苍术Atractylodes  lancea (Thunb.) DC. 的根茎。干燥后，粉碎，过50目筛，备用。DEAE纤维素（Whatman公司）、Sephadex G-100、分子量标准品葡聚糖Dextran系列、单糖标准品（Sigma公司），其他化学试剂均为国产分析纯。
       1.2  仪器
       JASCO LC1500高效液相色谱系统，日本分光公司；TSK-G4000PW，日本TOSOH公司；Avatar360傅立叶红外光谱仪，美国尼高力公司；GC-14B气相色谱仪，日本岛津公司；N2000色谱处理工作站，浙江大学智能研究所；紫外可见分光光度计，上海优尼科公司；恒流泵、自动分部收集器(上海沪西仪器厂)；冷冻干燥机，德国Christ公司。
       2  方法
       2.1  茅苍术粗多糖的提取取粉碎后的茅苍术（500 g），用无水乙醇回流脱脂，残渣通风晾干后加5 000 ml蒸馏水，90℃提取4次，合并提取液，减压浓缩至一定体积。冰浴条件下加三氯乙酸脱蛋白，离心除去变性蛋白，上清液迅速用NaOH中和至pH=7.0，浓缩至适量，透析除去小分子杂质，再减压浓缩，加4倍体积的95%乙醇，4℃放置过夜，离心收集沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，挥干乙醚后，复溶于水，冷冻干燥。即得水提粗多糖APW。
       2.2  APW分离纯化取APW加水溶解，以DEAE-52纤维素柱（50 cm×2.6 cm）析层析，依次用0.00～2.00 mol/L的NaCl溶液洗脱，分别收集洗脱液（每管10 ml），以改良的苯酚硫酸法［7］跟踪检测，根据洗脱曲线收集。取0.02～0.20 mol/L的NaCl溶液洗脱部分，蒸馏水透析3 d，冷冻干燥，再经Sephadex G-100柱层析（60 cm×1.0 cm）层析，0.1 mol/L NaCl洗脱，以改良的苯酚硫酸法跟踪测定，根据洗脱曲线收集，并经HPLC凝胶柱检测，得到较为纯化的茅苍术多糖APW1，APW2，APW3和APW4。
       2.3  茅苍术多糖的分子量测定色谱条件：JASCO RI-1530 示差检测器，JASCO PU-1580泵，TSK-G4000PW色谱柱，柱温30℃，流动相0.003 mol/L 醋酸钠，流速为0.5 ml/min 。
       2.3.1  标准曲线的制作分别称取平均分子量为2 000, 500, 70, 40, 10 kDal的Dextran系列标准葡聚糖5.0 mg，用1 ml 流动相溶解，0.45 μm滤膜过滤后,吸取20 μl注入高效液相色谱中，以分子量的对数为纵坐标,以各糖的保留时间为横坐标,绘制标准曲线。
       2.3.2  样品分子量测定取纯化后的样品各 5 mg与1 ml流动相溶解，按与Dextran标准品相同的色谱条件操作，求得各自相应的保留时间，按标准曲线计算分子量。
       2.4  茅苍术多糖组成单糖的组分分析
       2.4.1  红外色谱分析分别称多糖各1 mg干燥样品，与KBr研磨混合后压片，采用Avatar360红外光谱仪扫描分析，波长范围为4000～400 cm-1，尤其观察800～900 cm-1的吸收峰。
       2.4.2  多糖的水解取APW1，APW2，APW3和APW4各5 mg干燥样品，加入2.0 mol/L的H2SO4溶液0.5 ml，封管，100℃水解12 h，取出，加入BaCO3中和，3 000 r/min离心除去BaSO4沉淀，上清液冷冻干燥，供分析用。
       2.4.3  薄层色谱分析分别称取Ｌ鼠李糖、Ｄ阿拉伯糖、Ｄ甘露糖、Ｄ葡萄糖、Ｄ半乳糖和D木糖各15 mg，分别定容于10 ml容量瓶中，得各单糖标准品溶液。另取各单糖标准品溶液1 ml等量混合，得单糖标准品混合溶液。
        取单糖标准品溶液和混合单糖标准品溶液，分别点于含0.3 mol/L的磷酸二氢钠的硅胶G板上，以丙酮∶水=24∶1及正丁醇∶醋酸乙酯∶异丙醇∶醋酸∶水∶吡啶=7∶20∶12∶7∶6∶7进行二次展开，取出，晾干后，喷苯胺-邻苯二甲酸显色,计算Rf值。
        样品APW1、APW2、APW3和APW4水解液和混合单糖标准品溶液，按相同的方法展开、显色，计算各Rf值并进行样品与标准品可见光与荧光下的对比。
       2.4.4  气相色谱分析采用糖腈乙酰法［8］制备衍生物：分别称取标准单糖和多糖水解后的糖样各10 mg，加入盐酸羟胺10 mg，内标肌醇7 mg和吡啶0.5 ml，于90℃水浴加热30 min并振荡，取出冷却至室温，加入醋酸酐0.5 ml，在90℃继续加热30 min进行乙酰化，产物浓缩至干，加入0.5 ml氯仿溶解，溶液经0.45 μm滤膜过滤后，注入气相色谱仪进行分析。
        色谱条件：DB-5 30000 mm×0.53 mm弹性石英毛细管色谱柱；载气：高纯氮气；检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；程序升温：100℃（5℃/min）→190℃，190℃（4℃/min）→240℃（5min）；汽化温度280℃；检测器260℃。
       3  结果
       3.1  茅苍术多糖的提取纯化茅苍术粉末经脱脂、水提、脱蛋白、醇沉，冷冻干燥后得到APW多糖组分为14.25 g，收率为2.85%。APW经DEAE-52纤维素柱层析，以改良的苯酚硫酸法跟踪检测，得4个主要组分APW1～4。这4个组分再过Sephadex G-100凝胶柱，以改良的苯酚-硫酸法跟踪测定，收集液经HPLC凝胶柱检测为单一对称峰。
       3.2  茅苍术多糖的分子量测定由保留时间t对标准分子量的对数做图，得标准曲线Y＝34.785-3.436 7X，r＝0.995，其中X为分子量的对数（lgMw），Y为保留时间。结果见图1。
        APW1～4的保留时间分别为21.982，18.511，14.698，13.075 min，代入回归方程得平均分子量分别约为：5.3×103 ，5.4×104，7.0×105，2.0×106。
       3.3  茅苍术多糖APW1，APW2，APW3和APW4单糖的组成分析
       3.3.1  甘露糖分析多糖中如有甘露糖组分，其红外光谱均呈现810 cm-1及870 cm-1左右的特征吸收峰［9］。红外扫描显示，4种茅苍术多糖均有该特征吸收峰，说明均含有甘露峰组分。
       3.3.2  薄层色谱分析结果各标准单糖在薄层板上获得了良好的分离，各标准单糖的Rf值见表1。表1  各标准单糖的Rf值（略）
        通过各单糖标样斑点与茅苍术多糖水解所得单糖斑点的颜色和Rf值比对，确定茅苍术多糖样品中的单糖组成。结果表明，茅苍术多糖纯化得APW1由Rha，Ara，Xyl，Man，Glu，Gal组成，APW2由Ara，Man，Gal组成；APW3，APW4均由Rha ，Ara，Man，Gal组成。
       3.3.3  气相色谱分析结果标准单糖及茅苍术多糖APW1, APW2,APW3,APW4的气相色谱见图2～6。由色谱图可以看出各单糖在此色谱条件下获得了良好的分离。
        根据各标准单糖的气相色谱图确定各单糖的保留时间和响应因子。结果见表2。表2  标准单糖、内标糖腈乙酰化物结果分析（略）
        多糖的气相色谱通过与标准单糖的保留时间和响应因子对比确定糖的种类和摩尔比。结果表明，茅苍术多糖纯化得APW1由Rha，Ara，Xyl，Man，Glu，Gal组成，其摩尔比为0.16∶0.17∶0.24∶0.55∶0.89∶1.00；APW2由Ara，Man，Gal组成，其摩尔比为0.82∶1.00∶0.32；APW3，APW4均由Rha ，Ara，Man，Gal组成，但其摩尔比不同，分别为0.24∶1.00∶0.48∶0.53及0.22∶0.34∶1.00∶0.58。
       4  讨论
       4.1  多糖的脱蛋白，常有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等，对于植物多糖的脱蛋白，本实验中的三氯乙酸法，控制在冰浴条件下，具有操作简便、效果良好，且能避免氯仿等有毒溶剂的使用。
       4.2  在多糖类高分子的分子量测定中，由于分子的组成及空间结构不同，以葡聚糖为对照所得的分子量并非是分子量的绝对值；而且温度对示差器检测有一定的影响。
       4.3  多糖的红外光谱，730～960 cm-1数据特别有意义，不仅可以区别 α及β型吡喃环，而且多糖中有甘露糖组分的，均呈现810 cm-1及870 cm-1特征吸收峰。气相衍生物采用糖腈乙酸酯法，具有制备简单、试剂易得的优点，且每种糖能得到单一的色谱峰；另外将反应物浓缩至干，加入适量氯仿可有效减少溶剂峰的拖尾。
       4.3  本实验初步弄清了茅苍术多糖的分子量及各自单糖组成，所得各多糖的纯化物均含有阿拉伯糖及半乳糖，与有关文献的活性部位一致［6］，为茅苍术多糖的进一步结构分析和活性研究奠定了基础。
        
       【参考文献】
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