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       【摘要】 
       目的观察黄芩素对大鼠子宫内膜异位症防治作用及其机制。方法采用手术移植法制备大鼠子宫内膜异位症模型,大鼠随机分为正常对照组、模型对照组和黄芩素高、低剂量组，测定大鼠的血清TNFα，IL6，IL8含量及脾脏NK细胞活性，采用免疫组织化学的方法检测异位内膜标本中Bcl2，ICAM1的表达。结果黄芩素治疗组与模型组相比血清TNFα，IL6，IL8活性明显降低，脾脏NK细胞活性显著增高，异位内膜标本中ICAM1， Bcl2表达明显下降。结论 黄芩素对子宫内膜异位症大鼠具有治疗作用，其作用机制可能与其抑制TNFα，IL6，IL8产生，抑制ICAM1 ，BcI2的表达以及增强脾脏NK细胞活性有关。
       【关键词】  黄芩素；子宫内膜异位症；自然杀伤细胞；细胞间黏附分子1
       
       The Therapeutic Effects of Scutellarin on Endometriosis in Rats 
       ZHANG Jun， WAN Shuqiong
       1.Huangshi LiKang Corporation of Medicine and Medical Apparatus,  435000， China；
       2.Department of Gynecology and Obstetrics , Tongji Hospital ,Tongji Medical College , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430030 ，China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the therapeutic effects and mechanism of scutellarin on endometriosis in rats.MethodsThe endometriosis  model of rats was created by surgical implantation and rats were randomly divided into four groups. At the end of the experiment,the activities of serum TNFα，IL6，IL8  were observed, the expression of Bcl2 and ICAM-1  were also observed by immunohistochemistry and the activity of nature kill cell in spleen was measured.  ResultsThe activities of serum TNFα，IL6，IL8 in scutellarin groups were lower than those in the model control group , the expressions of Bcl2，ICAM1 in scutellarin groups were lower than those in the model control group ,the activity of nature kill cell in spleen of scutellarin groups rose more significantly than that of the model control group .ConclusionScutellarin may have the therapeutic effect on the endometriosis  of rats by inhibiting the producing of serum TNFα，IL6，IL8 , decreasing the expressions of Bcl2，ICAM-1 and enhancing the activity of nature kill cell in spleen.
       Key words：Scutellarin;   Endometriosis;   NK cell;   ICAM1
        子宫内膜异位症(endometriosis EM) 是一种常见的妇科疾病，主要指子宫内膜在子宫腔被覆面以外的地方种植生长，是一种具有侵袭性的良性病变。该病的临床表现主要为顽固性的痛经，腹痛及不孕等，成为危害当今育龄妇女健康及生活质量的一种很重要的疾病。EM在育龄妇女中发病率约15%左右，在不孕妇女中高达50%，其发生机制可能与体腔上皮化生学、激素、免疫、环境、遗传学说等因素相关［1，2］。黄酮类化合物是一类低分子的广泛分布于植物界的天然植物成分,具有多方面的生物活性,如:抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、免疫调节以及抗肿瘤作用等。黄芩素（scutellarin）是从黄芩中提取的一种黄酮类单体化合物［3］。本实验通过建立大鼠子宫内膜异位症模型后给予黄芩素进行治疗，观察黄芩素对子宫内膜异位症大鼠细胞因子，ICAM1及凋亡相关因素的影响，为探讨子宫内膜异位症的治疗提供理论和实验依据。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       雌性Wistar大鼠，体重为（220±20） g，鼠龄8～12周，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。黄芩素：sigma公司；大鼠IL6， TNFa检测试剂盒、大鼠IL8 ELISA检测试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司；Bcl2检测试剂盒、大鼠ICAM1检测试剂盒：武汉博士德生物技术有限公司；其余为国产分析醇。I125一放免测定仪及FJ2107液体闪烁计数器：西安262厂；ELISA酶标仪：美国BioRed公司2550型。
       1.2  动物模型及分组造模方法［4］：雌性未孕Wistar大鼠，体重（220±20）g。皮下注射乙烯雌酚0.2 mg/只促情，以20%乌拉坦1.5 g/kg ip麻醉，待麻醉生效后，将大鼠固定操作台上，腹部剪毛，碘伏消毒，在无菌条件下开腹，约1.5 cm长，右侧离卵巢0.5 cm处分离子宫，结扎后在中间剪取约2 cm一段子宫，剖开子宫剥离子宫内膜，将内膜剪成3块，分别缝于子宫分叉处、左侧卵巢附近、左侧腹膜壁层，关腹缝合。每鼠ip庆大霉素0.1 ml × 3 d，正常清洁饲养。
       
       正常饲养1个月后再次开腹，大鼠异位组织生长好，肉眼观察见移植物体积增大，呈结节状、囊状，内有液体积聚，有的为内含血性液的囊性小泡，周围被结缔组织覆盖，并有血管生成，表明模型成功。实验分4组:正常对照组、模型对照组、黄芩素高剂量组（4 mg/kg），黄芩素低剂量组（2 mg/kg），于造模1个月后腹腔给药，连续4周，4周后无菌摘取大鼠眼球取血，然后断头处死，剖取大鼠在位及异位子宫内膜组织及脾组织。
       1.3 检测指标
       1.3.1  病理组织HE染色取部分大鼠在位及异位子宫内膜组织立即固定于10%中性福尔马林中，然后酒精梯度脱水，二甲苯透明浸蜡，石蜡包埋后常规切片, HE染色，光学显微镜检查。
       1.3.2  血浆PGF2a，PGE2检测采用放免法检测。
       1.3.3 细胞因子检测血清TNF α，IL6活性测定采用RIA法；血清IL8检测采用ELISA双抗体夹心法，按试剂盒说明书操作。
       1.3.4  BCL2检测组织石蜡切片后按免疫组化试剂盒操作说明进行。
       1.3.5  ICAM1检测取出的异位内膜新鲜组织，迅速放入液氮低温冷冻固定后，进行连续冰冻切片；室温放置30 min后，入4℃丙酮固定10 min，PBS洗，5 min 3次；3%过氧化氢孵育5～10 min，清除内源性过氧化物酶的活性；PBS洗，5 min× 2次；下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。
       1.3.6  NK细胞活性检测各组大鼠处死后酒精浴，超净台中分别取脾，研磨、分离成单细胞悬液，用完全培养基调整细胞数为5×l06/ml，培养Yac1细胞，于生长旺盛期将细胞离心，调整Yac-1细胞浓度与脾细胞浓度为1∶50，加入到96孔板中，同时分别设脾细胞和Yac1细胞对照孔，5%CO2，37℃ 培养4 h，离心弃上清，每孔加入MTT 0.5 mg/ml，继续培养4 h，1 500 r/min离心弃上清，每孔加入盐酸异丙醇，充分溶解结晶颗粒，于570 nm测定光密度OD值，并计算其杀伤率。计算公式：NK细胞杀伤活性(%)=［1－(实验孔OD一脾细胞对照孔OD)/Yac-1对照孔OD］×100%。
       1.4  统计学方法所有数据用±s表示，组间比较采用t检验处理。
       2  结果
       2.1  病理组织HE染色模型组：异位内膜呈子宫腔状或环形锯齿状封闭式结构，有囊肿形成，囊壁厚。腺体数目多，腺体上皮呈柱状，腺腔大，增生现象明显，向间质生长，呈假腺体改变。间质中有大量炎细胞浸润，血管较多。治疗组：异位内膜呈缝隙状，个别呈环状封闭式结构，多无囊肿形成。异位内膜极薄，呈萎缩性改变，腺体数目少，腺腔小，腺上皮呈扁平或矮立方形，未见假腺体改变，间质细胞小而稀疏，并有纤维化倾向,有少量白细胞浸润，血管较模型组少。
       2.2  黄芩素对子宫内膜异位大鼠血浆PGF2α，PGE2的影响与正常对照组相比模型组大鼠外周血中PGF2α，PGE2含量显著升高（P＜0.01），黄芩素与模型组相比外周血中PGF2α，PGE2含量明显降低，两者有明显差异性（P＜0.01或P＜0.05）。结果见表1。表1  黄芩素对子宫内膜异位大鼠血浆PGF2a，PGE2的影响（略）
       2.3  黄芩素对子宫内膜异位大鼠血清细胞因子的影响
       模型组大鼠外周血中TNFα，IL6，IL8含量明显高于正常对照组，黄芩素能降低外周血中TNFα，IL6，IL8含量，使TNFα，IL6，IL8含量趋于正常水平，与模型组相比有明显差异性（P＜0.01或P＜0.05）。结果见表2。表2  黄芩素对子宫内膜异位大鼠血清TNFα，IL6，IL8的影响(略)
       2.4  黄芩素对子宫内膜异位大鼠ICAM-1表达的影响
       细胞膜和细胞浆棕色反应为阳性，无棕色反应为阴性。实验结果显示，模型组大鼠细胞膜和细胞均呈浆棕色反应，模型组局部组织ICAM- 1阳性表达明显强于正常组，黄芩素能明显降低子宫内膜异位大鼠局部ICAM- 1含量，以高剂量组效果明显，使ICAM- 1表达趋于正常，与正常组相比无显著性差异。结果见表3。表3  黄芩素对子宫内膜异位大鼠NK细胞活性的影响（略）
       3  讨论
        子宫内膜异位症自1860年首次发现至今其发病机制仍不清楚，治疗的副作用较大且治疗后容易复发，临床处理十分棘手。近年来研究发现，子宫内膜异位症患者血中的免疫异常是继发于细胞免疫功能缺陷。在子宫内膜异位症患者腹腔中的巨噬细胞、NK细胞及T细胞的细胞毒性作用被抑制，而外周血单核细胞又可以刺激子宫内膜细胞在异位种植和生长，子宫内膜细胞在腹腔中成功种植以后，在一些内分泌的、免疫的及血管形成因子的作用下进一步的发展成为子宫内膜异位症。
        越来越多的证据表明，细胞因子在子宫内膜异位症的形成、发展中起重要作用。细胞因子是由细胞产生，在细胞间相互作用并沟通信息的一类介导炎症和免疫反应的多肽类蛋白，有着广泛而复杂的生物学活性。在子宫内膜异位症患者腹腔液中巨噬细胞数量增多、活性增强，活化的巨噬细胞释放TNFα，IL2, IL6, IL8, IL10, IL13等一系列细胞因子，细胞因子在腹腔液内通过局部渐而作用全身［5］。通过刺激T, B淋巴细胞增殖、活化，介导免疫反应，促进前列腺素如PGF2α，PGE2合成，并且导致局部纤维母细胞增生、胶原沉积和纤维蛋白形成，使得盆腔纤维化和粘连，促进子宫内膜异位症的发展［6］。
        ICAM- 1是粘附分子免疫球蛋白超家族中非常重要的一种，存在于细胞表面，介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的分子。研究表明［7］，异位内膜ICAM- 1蛋白表达量明显高于对照组。ICAM-1表达升高一方面直接促进异位内膜黏附种植，另一方面可产生免疫抑制和降低NK细胞活性［8］。NK细胞活性下降可使异位内膜细胞未能被识别、溶解和清除，而有机会进一步黏附种植。因此ICAM 1可能是异位内膜细胞逃避免疫监视，进而黏附侵袭种植的机理之一。
        研究也发现子宫内膜异位症异位内膜细胞生长特性可能与细胞凋亡改变有关，多种凋亡相关基因参与其中并相互影响。在EM患者正常位和异位子宫内膜中都有Bcl2表达［9］。EM患者的正常位子宫内膜在增生期Bcl2蛋白阳性率高，到黄体后期，Bcl-2阳性率降低，在异位子宫内膜组织Bcl2呈阳性。异位内膜细胞可通过Bcl2基因的高表达而增强自身的抗凋亡能力，延长其寿命，得以在宫腔外存活及种植，形成异位病灶。
        本实验通过手术将大鼠子宫内膜移植到卵巢周围组织及腹壁的方法成功复制子宫内膜异位症的模型，给予黄芩素进行治疗。结果发现黄芩素能明显减轻子宫内膜异位症大鼠的病理损伤，降低血中前列腺素（PGF2a，PGE2）的合成，抑制TNFα，IL6，IL8等细胞因子的表达以及增强脾脏NK细胞活性。同时也发现黄芩素通过降低异位内膜细胞中Bcl-2的表达和ICAM - 1蛋白的表达，使异位内膜细胞的凋亡抑制解除，缩短异位内膜细胞的寿命，并且抑制异位内膜的黏附、侵袭、种植，达到清除异位病灶从而达到治疗子宫内膜异位症的目的。
       【参考文献】
         　　［1］Vasquez J, Bastias C, Mink MB. Techniques of Treatment of Peritoneal Endometriosis: The Cavitational Ultrasonic Surgical Aspirator［J］.Surg Technol Int. 1998，VII：263.
       
       ［2］Dmowski WP, Gebel H, Braun DP. Decreased apoptosis and sensitivity to macrophage mediated cytolysis of endometrial cells in endometriosis［J］.Hum Reprod Update. 1998 ，4(5)：696.
       
       ［3］陈季武， 朱振勤， 胡天喜，等.天然黄酮类化合物清除羟自由基的构效关系［J］.中国药理学报，2002，23（7）：667.
       
       ［4］刘建文. 药理实验方法学［M］.北京：化学工业出版社， 2003.
       
       ［5］Darai E, Detchev R, Hugol D, Quang NT. Serum and cyst fluid levels of interleukin (IL) 6, IL8 and tumour necrosis factor-alpha in women with endometriomas and benign and malignant cystic ovarian tumours［J］. Hum Reprod. 2003 Aug;18(8)：1681.
       
       ［6］Muzii L, Marana R, Brunetti L. Atypical endometriosis revisited: clinical and biochemical evaluation of the different forms of superficial implants［J］.Fertil Steril，2000 Oct，74(4)：739.
       
       ［7］Vigano P, Gaffuri B, Somigliana E. Expression of intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 mRNA and protein is enhanced in endometriosis versus endometrial stromal cells in culture［J］.Mol Hum Reprod. 1998，4(12)：1150.
       
       ［8］Vigano P, Gaffuri B, Ragni G Intercellular adhesion molecule-1 is expressed on human granulosa cells and mediates their binding to lymphoid cells［J］.J Clin Endocrinol Metab. 1997，82(1)：101.
       
       ［9］Watanabe H, Kanzaki H, Narukawa S. Bcl-2 and Fas expression in eutopic and ectopic human endometrium during the menstrual cycle in relation to endometrial cell apoptosis［J］.Am J Obstet Gynecol. 1997 ，176(2)：360.