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       【摘要】 
       目的建立感冒止咳胶囊的质量标准。方法采用HPLC法对感冒止咳胶囊中的黄芩苷进行含量测定，流动相为甲醇-0.4%磷酸（55：45），检测波长277 nm。采用薄层色谱法对制剂中主要药味黄芩、金银花、葛根、青蒿、柴胡等进行定性鉴别。结果黄芩苷的线性范围为0.049～2.040 μg （r=0.999 95，n=5），平均回收率为98.10%，相对标准偏差为1.83%。薄层图谱斑点清晰，可鉴别出黄芩、金银花、葛根、青蒿对应的斑点，阴性对照无干扰。结论可用于感冒止咳胶囊的质量控制。
       【关键词】  感冒止咳胶囊； 黄芩苷； 高效液相色谱； 薄层色谱法； 质量标准
       
       Studies on the Quality Standard of Ganmao Zhike Capsules
       JIANG Xueping， CHEN Keli， YE Congjin
       Hubei College of Traditional Chinese Medicine,  Wuhan  430061, China
       Abstract：ObjectiveTo establish the quality control standard of Ganmao Zhike Capsules.MethodsThe content of baicalin in the capsules was determined by HPLC with the mobile phase consisting of methanol－0. 4% phosphoric acid (55:45) and UV detection wavelength at 277nm. Thin-layer chromatography (TLC) was employed to check  the  subsistent Radix Scutellarlae, Flos Lonicerae Japonicae, Radix Puerariae Lobatae, Herba Artemisiae Annuae, Radix Bupleuri.ResultsBaicalin showed a good linearity in the range 0.049～2.040μg （r=0.999 95，n=5），the average recovery was 98.10% and RSD was 1.83%. The TLC could detect the corresponding chromatographic spots of Radix Scutellarlae, Flos Lonicerae Japonicae, Radix Puerariae Lobatae, Herba Artemisiae Annuae without the interference of negative control group. ConclusionThe method can be used for the quality control of Ganmao Zhike Capsules.
       Key words：Ganmao Zhike Capsules;  Baicalin;  HPLC;  TLC;  Quality standard
        感冒止咳胶囊是由感冒止咳冲剂改剂型而得，原方收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第2册，由黄芩、柴胡、金银花等中药组成，具有清热解表、止咳化痰的功效。用于感冒发热，头痛鼻塞，伤风咳嗽，咽喉肿痛，四肢怠倦，流行性感冒。黄芩为方中主药，其所含黄芩苷为主要有效成分之一，也是其指标性成分，本文为建立感冒止咳胶囊的质量标准，采用HPLC法测定方中黄芩的黄芩苷含量，同时对主要药味黄芩、金银花、葛根、青蒿进行薄层鉴别。
       1  仪器与试药
        DIONEX P680高效液相色谱仪；岛津LC-10AT高效液相色谱仪；梅特勒-托利多电子天平AE100（精密为0.0001g）；梅特勒-托利多电子天平M3（精度为0.001mg），PERKIN ELMER Lambda12型紫外扫描仪，数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；甲醇、磷酸为色谱纯，水为二次蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
        黄芩苷对照品（批号110715-200212）、绿原酸对照品（批号110753-200212）、葛根素对照品（批号110752-200209）、青蒿对照药材（批号121016-200403）均购于中国药品生物制品检定所。感冒止咳胶囊（市场购得，批号20050601，20050602，20050603），阴性样品（实验室自制）。
       2  方法与结果
       2.1  薄层定性鉴别
       2.1.1   黄芩、金银花的薄层定性鉴别［1］取样品2粒，加50%甲醇10 ml，超声处理20 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取绿原酸、黄芩苷对照品，分别加50%甲醇制成每毫升各含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。按样品制备方法制得缺黄芩、金银花阴性对照溶液。照薄层色谱法［2］实验，吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以醋酸丁酯-甲酸-水（7:4:3）的上层溶液为展开剂，预饱和30 min后，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与黄芩苷、绿原酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
       2.1.2  葛根的薄层定性鉴别［1］样品6粒，加醋酸乙酯25 ml超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5 ml使溶解，作为供试品溶液。另取葛根素对照品，加甲醇制成每毫升含0.4 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［2］实验，吸取上述两种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（7:2.5:0.25）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
       2.1.3  青蒿的薄层定性鉴别取样品2粒，加水20 ml超声使溶解，滤过，滤液置分液漏斗中，用醋酸乙酯提取2次，20 ml/次，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。另取青蒿对照药材1 g，加水15 ml，加热回流1 h，滤过，滤液用醋酸乙酯10 ml提取，分取醋酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇2 ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法［2］实验，吸取上述2种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯（17:3）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与青蒿对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
       2.2  含量测定2.2.1  色谱条件色谱柱为Agilent Kromasil C18，流动相：甲醇-0.4%磷酸（55∶45），检测波长：277 nm，流速：1.000 ml/min，柱温25℃，进样量10 μl，理论板数按黄芩苷计应不低于2 500。
       2.2.2  样品溶液的制备取样品适量，研细，取粉末约0.5 g，精密称定，置100 ml锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液1 ml置10 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。
       2.2.3  检测波长的选定精密称取黄芩苷对照品，加甲醇溶解制成每毫升含黄芩苷对照品25 μg的溶液，于200～400 nm范围内进行紫外扫描，可以看到黄芩苷在277 nm处有最大吸收峰，故选择277 nm为检测波长。
       2.2.4  耐用性实验考察
       2.2.4.1  液相色谱法
        流动相组成比例：根据2005年版《中国药典》中黄芩项下黄芩苷的含量测定条件以及预实验的结果，分别进行了甲醇-0.4%磷酸（55∶45）、甲醇-0.4%磷酸（50∶50）、甲醇-0.4%磷酸（60∶40）组成比例的研究，对同一批（批号：20050603）样品进行了含量测定研究，结果表明当组成为甲醇-0.4%磷酸（55∶45）时，保留时间适当，峰形以及峰分离度较好。
        流动相的pH值：取同一批样品溶液（批号：20050603），分别采用了0.1%磷酸、0.4%磷酸、0.5%磷酸作为流动相，进行了含量测定，结果表明流动相的pH值对峰形和峰分离度的影响很大，但是甲醇-0.4%磷酸（55∶45）系统与甲醇-0.5%磷酸（55∶45）系统基本上没有差别。考虑到色谱柱的对酸、碱的耐受性以及使用寿命，选择酸的浓度为0.4%磷酸，即流动相为甲醇-0.4%磷酸（55∶45）。
        检测波长：取同一批样品溶液（批号：20050603），经选用272，277，282 nm作为检测波长，对样品溶液进样测定分析，黄芩苷的平均含量为11.66 mg/粒，RSD为0.92%。
        柱温：取同一批样品溶液（批号：20050603），经选用20，25，30℃作为柱温，对样品溶液进样测定分析，黄芩苷的平均含量为11.62 mg/粒，RSD为0.62%。
        变动色谱柱：取同一批样品溶液（批号20050603），经选用汉邦Kromasil C18、汉邦Lichrospher C18 、Agilent Kromasil C18不同色谱柱，进行含量测定，黄芩苷的平均含量为11.56 mg/粒，RSD为0.65%。
        稳定性实验：取同一批样品溶液（批号20050601），分别于0，2，4，8，12，24h进样10 μl测定，黄芩苷的平均峰面积为657425，RSD为1.42%。结果表明样品溶液在24 h内稳定。
       2.2.4.2  样品溶液制备方法的考察取同一批样品（批号20050603），分别采用回流提取3 h与超声提取30 min，测定黄芩苷的含量分别为，11.60 mg/粒。
       2.2.5  线性关系考察精密称取黄芩苷对照品，分别制成0.004 9，0.024 50，0.051 0，0.102 0，0.204 0 μg/μl的溶液，各精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量（μg，X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明黄芩苷进样量在0.049～2.040 μg的范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系，回归方程为：y=51.188x－0.546 7，r=0.999 95（n=5）。
       2.2.6  准确度实验采用加样回收法，取已知含量的同批（批号20050602）样品约0.5 g，研细，精密称定6份，每份各精密加入黄芩苷对照品约10 mg，按样品溶液的制备方法进行操作，测定。黄芩苷的平均回收率为98.10%，相对标准偏差为1.83%。结果见表1。表1  黄芩苷含量测定准确度测定结果（略）
       2.2.7  精密度实验重复性：取同一批样品（批号20050603）约0.5 g，研细，精密称定6份，按样品溶液的制备方法进行操作，测定。结果表明黄芩苷的平均含量为11.65 mg/粒，RSD为1.03%。
        中间精密度：取同一批样品溶液（批号20050603），分别采用DIONEX P680高效液相色谱仪和岛津LC-10AT高效液相色谱仪测定，黄芩苷含量为11.62 mg/粒和11.57 mg/粒。
        重现性：取3批样品溶液（批号20050601，20050602，20050603），分别在两个不同单位用HPLC法测定，3批样品黄芩苷含量平均值+偏差为（10.62±0.11），（11.24±0.12），（11.54±0.21） mg/粒，结果表明，重现性良好。
       2.2.8  专属性实验按处方比例制备不含黄芩药材的感冒止咳胶囊样品，按样品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别精密吸取黄芩苷对照品溶液、样品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，结果表明，阴性对照无干扰。见图1。
       2.2.9  范围考察考察本品含量测定方法的范围的低限为限度的-50%（供试品溶液的制备的取样量为0.25 g），高限为限度的+50%（供试品溶液的制备的取样量为0.75 g）。在范围的高、低限，对同一批号的样品（批号：20050603）分别考察了精密度和准确度，结果表明：低限为-50%，高限为+50%时，本品含量测定方法精密度和准确度较好，精密度RSD值（从低限到高限）分别为0.81%，1.03%，0.93%，准确度RSD值（从低限到高限）分别为2.84%， 2.94%。
       2.2.10  样品的含量测定按照上述方法测定3批样品中黄芩苷的含量。结果见表2。表2  含量测定结果
       3  讨论
        原《卫生部药品标准》感冒止咳冲剂没有较明确的质量控制标准，王静等［1］制定了质量控制方法。
        该方法中测定的是感冒止咳冲剂中绿原酸的含量，但其含量比较低，为0.30%［1］，而黄芩苷含量高,达约2.3%，并且黄芩苷也是主要的活性成分之一，因此，在我们的感冒止咳胶囊中选择黄芩苷为测量指标。在黄芩苷含量测定过程中，我们先按照2005版《中国药典》Ⅰ部211页“黄芩”项下的色谱条件甲醇水磷酸（47∶53∶0.2）为流动相进行测定，发现保留时间较长，峰形及分离度也不理想，故我们将此流动相系统作了改进。在薄层色谱鉴别中，我们参照了文献［1］中金银花、黄芩和葛根的薄层鉴别方法，并增加了青蒿的薄层鉴别，此外，我们亦对方中主药柴胡进行薄层研究，分别以柴胡对照药材和柴胡皂苷a作对照，但在样品色谱相对应位置，均未发现相同颜色斑点或荧光斑点。据文献报道，柴胡皂苷a,不稳定，在制剂过程中易转化成柴胡皂苷B1，B2，［3］加热提取时间对柴胡皂苷a含量影响较大，加热提取8 h，柴胡皂苷a已损失殆尽［4］，故此鉴别未列入质量标准。
       
       【参考文献】
         　　［1］王 静，徐艳红，陶春凤．感冒止咳冲剂质量标准研究［J］.时珍国医国药,2003,14(8)：473.
       
       ［2］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录VIB，211.
       
       ［3］闻晓光．熊胆复肝宁中柴胡皂苷的转化［J］．中成药，1993，15（3）：16.
       
       ［4］张 玲，时延增，徐新刚,等．加热提取时间对柴胡皂苷a含量的影响［J］．中草药，1997，28（4）：212.