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       【摘要】 
       目的测定桂皮醛在肾气丸各拆方组水煎液中的含量，分析肾气丸“阴中求阳”配伍对桂皮醛含量的影响。方法将肾气丸组方药物拆方分为补阳组1、补阳组2、补阴组1、补阴组2、阴阳双补组1和阴阳双补组2（即肾气丸全方），采用高效液相色谱法测定各肾气丸拆方组水煎液中桂皮醛的含量。结果阴阳双补组2水煎液中桂皮醛含量高于补阳组2和阴阳双补组1，阴阳双补组1和补阳组2水煎液中桂皮醛含量高于补阳组1，且都具有统计学意义。结论肾气丸“阴中求阳”配伍能增大水煎液中桂皮醛的含量，且肾气丸中的“三泻”药物（茯苓、泽泻、丹皮）也有增强此作用的趋势。
       【关键词】  肾气丸 阴中求阳 桂皮醛 高效液相色谱法
       肾气丸始载于《金匮要略》，由桂枝、附子、干地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮组成，有温补肾阳之功效，是临床治疗肾阳虚证的名方。其“阴中求阳”的组方原理，即在大量滋阴补肾的药物中加入少量的附子、桂枝，是方剂现代研究中值得探讨的课题。本研究将肾气丸的组方进行拆分，以桂枝的主要有效成分桂皮醛为指标，测定各肾气丸拆方组水煎液中桂皮醛的含量，并比较其含量变化。现报道如下。
       1  仪器与试剂
        1.1  仪器DIONEX P680 高效液相色谱仪；UVD170U型紫外可见光检测器；Chromeleon工作站；分析天平；超声清洗仪。
        1.2  试剂无水乙醇，乙醚，甲醇（色谱纯），其他试剂均达到色谱分析要求。
        1.3  对照品桂皮醛（中国药品生物制品检定所，批号为110710200212）。
        1.4  药材桂枝、附子、干地黄、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮均由广州中医药大学中药鉴定教研室张丹雁教授鉴定为正品。
       2  方法与结果
        2.1  拆方分组将肾气丸组方药物分为补阳组1：附子、桂枝；补阳组2：附子、桂枝＋茯苓、泽泻、丹皮；补阴组1：干地黄、山茱萸、山药；补阴组2：干地黄、山茱萸、山药＋茯苓、泽泻、丹皮；阴阳双补组1：附子、桂枝＋干地黄、山茱萸、山药；阴阳双补组2：即肾气丸全方。其中含有桂枝的组有：补阳组1，补阳组2，阴阳双补组1，阴阳双补组2。
        2.2  高效液相色谱条件 色谱柱 DiomonsilTM C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温为室温；流动相为甲醇-水（60：45），流速1 ml/min；检测波长310 nm；进样量10 μl。
        2.3  标准曲线制备  精密称取桂皮醛对照品17.2 mg，置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度（每毫升含桂皮醛0.344 mg），作为对照品储备溶液。分别精密量取对照品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 ml，置25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得桂皮醛标准溶液，取上述标准溶液，按“2.2”项下色谱条件分别进样10μl测定，以桂皮醛标准品液浓度为横坐标（C），峰面积为纵坐标（A），得回归方程A=0.840 7C- 0.263 3，r= 0.999，桂皮醛在5.504～19.264 μg/ml内线性关系良好，符合外标法定量测定要求。
        2.4  供试品溶液的制备精密称取含桂枝4 g（以桂枝、附子、干地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮1：1：8：4：4：3：3：3的比例计算）各拆方组，浸泡30 min，煎煮60 min，得药液约15 ml，用乙醚萃取2次（15 ml/次），合并醚液，室温挥干，残渣用甲醇溶解并定容至5 ml，用0.45 μm的有机微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
        2.5  精密度实验 取相同浓度对照品溶液，连续进样测定，根据所得峰面积计算，RSD = 1.15%，n=6。
        2.6  稳定性实验取供试品溶液在室温下放置，每隔2 h测定1次，共测定6次，按测得峰面积积分值计算，供试品在10 h内稳定，RSD = 1.65%。
        2.7  阴性对照实验  肾气丸全方按照含桂枝4 g的比例称取不含桂枝的其他药，按照上述供试品制备方法，制作阴性供试品溶液，用与样品相同的色谱条件测定，在与样品相同保留时间处无干扰峰。结果见图1～3。
        图1  桂皮醛对照品HPLC色谱图
        图2  肾气丸全方HPLC色谱图
        图3  肾气丸缺桂枝阴性对照色谱图
        2.8  样品测定按照含量测定方法测定各拆方组的样品，记录峰面积，计算桂皮醛在各拆方组中的含量，用SPSS统计软件进行分析。结果见表1，色谱图见图4～8。表1  样品含量测定结果（±s）
       3  讨论
        实验过程中流动相试用了甲醇水（30∶70）、甲醇水（45∶55）、甲醇水（50∶50）、甲醇水（60∶40）、甲醇水（70∶30）、甲醇水（60∶45）几个系统，以甲醇-水（60∶45）系统分离效果最优，各拆方组桂皮醛的理论塔板数均大于4 000；而检测波长选择试用了285，300，310 nm 3个波长，以310 nm时峰形最好，出峰时间在12 min左右。
        实验结果显示肾气丸全方（即阴阳双补组2）水煎液中桂皮醛含量高于桂枝、附子与“三泻”（茯苓、泽泻、丹皮）配伍组（即补阳组2），其次桂枝、附子与“三补”（干地黄、山茱萸、山药）的配伍组（即阴阳双补组1）水煎液中的桂皮醛含量高于桂枝、附子配伍组（即补阳组1），且具有统计学意义，说明配伍了补阴药——干地黄、山茱萸、山药有助于桂皮醛在水煎液中的溶出。而补阳组2含量高于补阳组1、阴阳双补组2含量高于阴阳双补组1，且有统计学意义，则说明无论是纯补阳组还是阴阳双补组，加用“三泻”（茯苓、泽泻、丹皮）后桂皮醛含量增高，茯苓、泽泻、丹皮亦有助于桂皮醛在水煎液中的溶出。即阴阳双补组水煎液中桂皮醛的含量高于纯补阳组，且“三泻”有增强此作用的趋势。
        对肾阳虚证的现代研究表明［1］，肾阳虚证具有下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴不同环节(层次) 、不同程度的功能紊乱，肾阳虚证与神经内分泌免疫网络有内在联系，补肾药是调节下丘脑、神经内分泌免疫网络、下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的有效手段。生理条件下，下丘脑产生的促肾上腺皮质释放激素经垂体门脉系统到达垂体，促进垂体促肾上腺皮质激素（ACTH）分泌，垂体分泌的ACTH进入血液，作用于肾上腺皮质细胞，促使其分泌皮质醇，而血浆皮质醇又可以反馈抑制CRH和ACTH的分泌。外源性糖皮质激素氢化可的松能明显降低血液中皮质醇、ACTH的含量，使肾上腺皮质分泌类固醇激素的释放减少，从而使大鼠表现出一系列的肾阳虚症状。
        桂皮醛是桂枝中的有效成分之一。有研究表明［2］桂皮醛进入循环系统后，到达肾上腺，促使肾上腺释放儿茶酚胺，从而提高血浆中儿茶酚胺的浓度。而儿茶酚胺对许多激素的分泌有促进作用，如 ACTH、胰高血糖素、生长素、甲状腺素、肾素等。而增加肾阳虚大鼠血中ACTH的含量，则可明显改善肾阳虚证症状。
        中医学认为阴阳相互依存，互为根本，“孤阴不生，独阳不长”。《医贯·阴阳论》曰：“阴阳又各互为其根，阳根于阴，阴根于阳；无阳则阴无以生，无阴则阳无以化”。肾阳虚证若单用大量的温补肾阳的药物反致虚不受补且有助热之弊，若在滋阴补肾的基础上加入少量温阳的药物，使阳得阴之助而生化有源，以达阴中求阳之效。肾气丸是“阴中求阳”配伍的代表方剂，方中大量滋阴补肾药配以少量温阳的桂枝、附子，在于温通阳气，使温阳而有生化之源，滋阴药得温阳药相助则滋而不腻，微微生火，“少火生气”，以鼓舞肾中真阳。
        综上所述，桂皮醛进入机体后通过作用于肾上腺，促使其释放儿茶酚胺，使血浆中儿茶酚胺的浓度增高，间接促进血中ACTH含量增加来改善肾阳虚证，结合本实验结果，以“阴中求阳”的肾气丸全方组水煎液中桂皮醛的含量最高，高于补阳组。实验结果提示肾气丸“阴中求阳”的配伍可能是通过桂皮醛提高血浆中儿茶酚胺的浓度来调节神经内分泌以治疗肾阳虚证，桂皮醛可能是肾气丸“阴中求阳”的配伍在治疗肾阳虚证中的有效成分之一。
       【参考文献】
         ［1］ 沈自尹．从肾本质研究到证本质研究的思考与实践［J］.上海中医药杂志，2000,34（4）：4.
       
       ［2］ Harada M，Hirayama Y，Yamazaki R．Pharmacological studies on Chinese cinnamon．V. Catecholamine releasing effect of cinnamaldehyde in dogs［J］．J Pharmacobiodyn，1982，5(8)：539.