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       【摘要】 
       目的观察岩黄连生物总碱对肝纤维化大鼠TGF-β1及MMP-9表达的影响，并探讨其抗纤维化的可能机制。方法Wistar大鼠80只随机分为6组，除正常组外其他各组首次皮下注射50% CCl4 5 ml·kg-1，以后每3天注射1次30% CCl4 3 ml·kg-1。正常组给予等体积花生油，持续12周，给药自造模之日开始。结果CCl4所致慢性肝纤维化大鼠有明显的肝损伤及慢性肝纤维化的表现。与模型组相比，岩黄连生物总碱三个剂量组能不同程度改善肝功能指标；肝组织中Hyp含量较模型组明显降低；病理组织学检查表明其肝脏病变程度较模型组明显减轻；肝组织中TGF-β1，MMP-9的表达较模型组明显下降。结论岩黄连生物总碱对慢性肝纤维化大鼠具有肝保护作用及抗肝纤维化作用,可能通过抑制TGF-β1和MMP-9表达而促进肝纤维化的逆转。
       【关键词】  岩黄连生物总碱 四氯化碳 肝纤维化
       肝纤维化是各种慢性肝脏疾病向肝硬化发展的必经阶段。阻断肝纤维化的发生和发展，对防治肝硬化和慢性肝病具有重要意义。我国是病毒性肝炎的高发区，目前肝纤维化的发病率呈上升趋势，严重危害人们健康。将肝脏病变终止于纤维化阶段或逆转之，是当前医学界关注的热点之一。岩黄连是一种纯中药制剂，实验研究已表明其对甲、乙、丙型肝炎病毒均有不同程度的抑制和杀灭作用。本实验旨在观察岩黄连生物总碱对CCl4所致大鼠慢性肝纤维化的肝保护作用及抗纤维化作用，并初步探讨其作用机制。
       1  材料
        1.1   动物 Wistar大鼠，清洁级，体重180～220g，雌雄各半，购于广西医科大学实验动物中心。
        1.2   药品与试剂 岩黄连生物总碱为广西药材岩黄连醇提取生物总碱，本实验室提供。四氯化碳，重庆川江化学试剂厂；联苯双酯，北京协和药厂；ALT，AST，TP，ALB，MDA，SOD，Hyp试剂盒，南京建成生物工程研究所；TGF-β1，MMP-9免疫组化染色试剂盒，北京中杉生物工程有限公司。
       2  方法
        2.1   动物分组及处理 Wistar大鼠80只，称重后随机分为6组，正常对照组10只，模型组、联苯双酯组（150 mg·kg-1）、CSA高剂量组（100 mg·kg-1）、CSA中剂量组(75 mg·kg-1) 、CSA低剂量组(50 mg·kg-1)各14只。首次按5 ml·kg-1给与大鼠大腿内侧及背部皮下注射50%CCl4，以后按30% CCl4 3 ml·kg-1，每周2次，连续12周，制备肝纤维化模型［1，2］。空白组用等体积花生油。造模同时CSA各剂量组及联苯双酯组每日灌胃给药，空白组和模型组则每日给与等体积生理盐水灌胃。
        2.2   生化指标观察 各组于末次给药后24 h，拔眼球取血，分离血清，按试剂盒说明 进行ALT，AST，TP，ALB等各项指标的测定，取出部分肝组织加冷生理盐水制成10%肝组织匀浆，按试剂盒说明进行MDA，SOD，Hyp指标的测定。
        2.3   肝组织病理学观察 末次给药24 h后处死大鼠，取肝大叶相同部位的一小块肝组织固定于10%甲醛溶液，常规脱水，石蜡包埋，制作组织切片，HE染色，普通光镜下观察。
        2.4   免疫组织化学观查 取出肝组织用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片机切片，按照试剂盒说明进行免疫组化染色，普通光镜观察。免疫组化染色以汇管区、中央静脉及细胞浆膜或间质有棕黄色颗粒或线状条索状沉积为阳性。免疫组化图像分析：每张切片随机选5个视野，利用病理图像分析软件(RGB)计算其灰度值，取其平均值，并加以统计学分析。
        2.5   统计学分析 数据以±s表示，采用SPSS12.0进行统计学分析，组间比较采用t检验，P<0.05说明差异具有显著性。
       3  结果
        3.1  一般状况 纤维化模型组大鼠毛色暗淡、精神萎靡，进食进水减少，易受惊，体重增长缓慢。处死后取肝组织可见模型组肝脏表面粗糙有结节，颜色灰暗，用手触摸感觉发硬，治疗组大鼠毛色较好，食欲尚可，肝组织损害较模型组轻，肝脏质地软，表面较光滑。
        3.2  CSA对慢性肝纤维化大鼠血清ALT，AST，TP，ALB的影响与正常组相比，模型组的ALT、AST明显升高，TP，ALB明显降低，P<0.01；与模型组相比，联苯双酯组和CSA高、中剂量组的ALT，AST明显降低，TP，ALB明显升高，P<0.01；CSA低剂量组与模型组相比，P<0.05。表1  CSA对CCl4所致大鼠慢性肝纤维化血清中ALT，AST，TP，ALB的影响与正常对照组比较 a P<0.01；与模型组比较 b P<0.01,c P<0.05
        3.3  CSA对慢性肝纤维化大鼠肝组织MDA，SOD，Hyp的影响与正常对照组相比，模型组MDA，Hyp明显升高，SOD明显降低，P<0.01；与模型组比较，联苯双酯组和CSA高、中剂量组MDA、Hyp明显降低，SOD明显升高，P<0.01；CSA低剂量组与模型组比较，P<0.05。表2  CSA对CCl4所致大鼠慢性肝纤维化肝组织中MDA、SOD、Hyp的影响 与正常对照组比较 a P<0.01；与模型组比较 b P<0.01,c P<0.05
        3.4  CSA对慢性肝纤维化大鼠肝组织病理学的影响正常对照组肝小叶及汇管区结构正常，肝细胞呈条索状以肝小叶中央静脉为中心向周围呈放射状排列，未见纤维化或变性、坏死；模型组大鼠肝组织正常结构被破坏，肝索排列紊乱，肝细胞肿胀变性，其中多为脂肪变，部分呈气球样变，窦旁细胞增生明显，胶原纤维大量增生，呈较宽的条索状分割肝小叶，弥漫分布，形成假小叶,有炎性细胞浸润；经CSA治疗各组病变程度较模型组轻，窦旁细胞轻度增生，纤维间隔略细，假小叶形成有所减少，汇管区及纤维间隔中有少量慢性炎细胞浸润；联苯双酯组病变程度较模型组明显减轻，纤维间隔细，假小叶形成减少。
        3.5  CSA对慢性肝纤维化大鼠TGF-β1、MMP-9的影响与正常对照组比较，模型组TGF-β1、MMP-9表达量均明显升高，P<0.01；与模型组比较，联苯双酯组两者表达量明显降低，P<0.01；CSA高剂量组与模型组相比TGF-β1、MMP-9的表达量也降低，分别为P<0.01和P<0.05；CSA中剂量组与模型组相比两者表达均降低，P<0.05；CSA低剂量组与模型组比较无统计学意义。表3  CSA对肝纤维化肝组织TGF-β1、MMP-9水平的影响与正常对照组比较 a P<0.01；与模型组比较 b P<0.01,c P<0.05
       4  讨论
        肝纤维化是肝硬化的早期阶段。肝纤维结缔组织异常增生，纤维化的发生与肝细胞坏死、间质炎症反应及肝细胞的再生缺陷有关［3，4］。四氯化碳是目前诱导肝纤维化的常用化学毒物,其机制与脂质过氧化有关,致细胞损伤达一定程度后引起肝内胶原纤维增多,随病程进展而迁延,从而形成肝纤维化［5］。
        肝脏是人体含酶量最丰富的脏器。在肝脏有实质性损伤时,有些酶可从受损肝细胞内大量逸出,使这些酶在血清中的活性升高,因此检测血清中某些酶的活性可灵敏地反映肝细胞受损的程度。本实验表明，CSA给药组能明显降低肝纤维化所引起的ALT、AST活性的升高。病理组织学检查也显示了CSA3个剂量组肝细胞炎性浸润较模型组明显减轻,肝细胞变性和坏死减少，表明CSA可改善肝功能,具有一定的保肝降酶作用。
        肝脏是人体蛋白质代谢的主要器官。当肝功能受损时，蛋白便会减少。因此，测定血清蛋白含量，可了解肝脏对蛋白质的代谢，有助于诊断和判断预后。本实验CSA各剂量组能升高纤维化引起的TP及ALB含量的减少，说明CSA可能能够干预肝脏蛋白质的合成过程。
        MDA是脂质过氧化的最终产物，它可使蛋白质、核酸及脂类发生交联，致生物膜发生变性，细胞突变、衰老或死亡。SOD是超氧阴离子自由基的清除剂，可抑制由自由基启动的脂质过氧化反应。这两个是反映脂质过氧化的敏感指标，还可间接反映出细胞损伤的程度。本实验中CSA给药组能降低肝纤维化大鼠肝组织中MDA含量，升高SOD含量，提示CSA的保护机制可能与抗过氧化有关。
        体内胶原蛋白代谢与肝纤维化密切相关,而血清游离羟脯氨酸(Hyp)是体内胶原特有的代谢产物。由于胶原纤维化时使所合成的胶原纤维最后都能沉积在肝内,特别是活动性肝纤维化时,胶原合成、降解的速度均加快,导致血清Hyp升高,故血清Hyp水平可间接反映体内胶原代谢情况。在本研究中,模型组大鼠肝组织匀浆中Hyp含量明显升高，CSA各组肝组织匀浆中Hyp含量较模型组明显减少，说明在纤维化过程中,肝组织胶原含量增加,而应用CSA后胶原沉积减少。
        TGF-β1与MMP-9均是肝纤维化的重要调控因素。MMP-9又称明胶酶B,主要作用于Ⅴ型胶原，对肝内基底膜结构的降解及在肝纤维化的发生过程中发挥着重要作用。TGF-β1是目前研究最深入的与肝脏疾病密切相关的细胞因子，是调控肝纤维化发生发展的核心物质［6］。该物质主要由活化的HSC分泌并激活，而TGF-β1又可促进、维持HSC的活化。研究发现，在MMPs的活化过程中，TGF-β1发挥重要调节作用，它通过调节基质金属酶的产生和活性来干扰细胞外基质的代谢［7］。本实验表明，模型组TGF-β1和MMP-9表达明显高于正常组，而CSA用药后各组的TGF-β1表达均有不同程度的下降，提示CSA在肝纤维化形成过程中可能参与了ECM的降解作用。
        综上所述，CSA能明显改善CCl4引起的慢性肝纤维化大鼠的肝功能指标，免疫组化结果显示CSA能降低肝组织中TGF-β1与MMP-9的表达 ，说明CSA具有抗纤维化的功能，其作用机制可能是：①抗过氧化脂质；②减少胶原沉积；③抑制HSC活化，降解ECM。本实验仅仅对CSA抗纤维化作了初步探讨，其详细机制有待于进一步研究。
       【参考文献】
         ［1］ 陈 奇．中药药理研究方法学［M］．北京：人民卫生出版社，1993：724．
       
       ［2］ 徐叔云，卞如濂，陈 修．药理实验方法学，第3版［M］．北京：人民卫生出版社，2002：1346．
       
       ［3］ 赵敏崎,韩得伍,马学惠,等.甘草酸、甘草次酸与柴胡皂甙对防治大鼠实验性肝硬化的作用［J］.药学学报, 1983, 18(5):325.
       
       ［4］ 于建国,白 薇,刘福义.肝纤维化与肝硬化［J］.临床军医杂志, 2004, 32(1): 102.
       
       ［5］ 武忠弼.病理学，第3版［M］.北京:人民卫生出版社, 1991:325.
       
       ［6］ Kinnman N,Andersson U,Hulterantz R.In situ expression of transforming growth factor-betal-3,latent transforming growth factor-beta binding protein and tumor necrosis factor-alpha in liver tissue from patients with chronic hepatitisC［J］.Scand J Gastroenterol 2000;35:1294.
       
       ［7］ Sato M,Shegogue D,Gore EA,Smith EA,McDermott PJ,Trojanowska M.Role of p38 MAPK in transforming growth factor beta stimulation of collagen production by scleroderma and healthy dermal fibroblasts［J］.J Invest Dermalol 2002;118:704.