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       【摘要】 
       目的探讨三七总皂苷（PNS）对快速老化小鼠SAMP8β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)表达的影响。方法采用免疫组织化学方法，在高倍显微镜下随机选取小鼠大脑顶叶皮层和海马周围白质连续五个视野，并计数五个视野APP免疫阳性细胞平均个数。结果PNS能明显减少快速老化小鼠大脑APP阳性细胞数量。结论PNS对SAMP8 APP的表达有明显抑制作用。
       【关键词】  三七总皂苷 快速老化小鼠 β-淀粉样蛋白前体蛋白 免疫组织化学
       阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease, AD）又称老年性痴呆，是一种原发性大脑神经退行性病变，为特有的中枢胆碱能神经元的大量死亡及丢失，伴有神经炎斑、神经纤维缠结的形成，并有含β折片结构的淀粉样蛋白（Amyliod-protein, Aβ）沉积［1］。Aβ沉积导致胆碱能神经细胞的损害，胆碱乙酰基转移酶（Choline Acetyltransferase, ChAT）水平下降和乙酰胆碱（Acetyl choline, Ach）递质合成的降低［2］。Ach在学习、记忆和活动中发挥重要作用。因而，治疗本病的关键是寻找能降低Aβ生成和沉积的药物。
        三七为五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen 的根，传统中医理论认为其性味甘、微苦、温，归肝胃经，具有化淤、止血、活血定痛之效。现代药理研究表明，三七对心血管系统、血液系统、免疫系统、神经系统等均有不同程度的药理作用，而对神经系统损害的保护作用尤为引人注目。此前的研究已表明，三七总皂苷(total saponins of Panax notoginseng, PNS)对以d-半乳糖腹腔注射致亚急性损伤合并鹅膏蕈氨酸(Ibotenic acid，IBA)损毁双侧大脑Meynert基底核建立的AD大鼠动物模型引起的胆碱能神经元损害具有保护作用［3］，这些作用是否通过减少Aβ的生成和沉积仍然是不清楚的。β-淀粉样蛋白前体蛋白(Amyliod β-protein precursor,APP)则与Aβ的形成量相关。为此，本研究应用免疫组织化学的方法在快速老化小鼠SAMP8模型评价了三七总皂苷（PNS）对β-淀粉样蛋白前体蛋白（APP)表达的影响。
       1  材料
        1.1  试剂多聚甲醛（polyoxymethylene）;PBS 缓冲液（0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.6）;蔗糖缓冲液（10％，20％，30％蔗糖缓冲液，0.1 PB, pH＝7.2～7.4）;Aβ1－40多克隆抗体：CHEMICON公司（批号：0507005616）；Aβ1－42多克隆抗体：CHEMICON公司（批号：0507003468）；APP多克隆抗体：CHEMICON公司（批号：25041098）；Max Vision试剂盒：福州迈新生物技术开发公司（批号：20061005）。
        1.2  试药PNS由云南玉溪维和制药厂生产（批号：20050701）；石杉碱甲组（双益平片）由浙江震元制药有限公司生产（产品批号：040801）。
        1.3  动物快速老化小鼠SAMP8（以下简称小鼠）70只，体重20～30 g。由天津中医药大学提供（合格证号：W－J津实动质M准字第006号）。
       2  方法
        2.1  动物分组及给药将购买的小鼠随机分为空白对照组（以下简称空白组）、PNS高剂量组（以下简称高剂量组）、PNS低剂量组（以下简称低剂量组）、石杉碱甲组（阳性对照组，以下简称阳性组），每组30只，另留10只（模型对照组，以下简称模型组）在给药前进行检测记忆、行为，以与用药后进行对照分析用，同时也用于检验模型是否成功。
        动物适应性喂养2周后给药，以双蒸馏水调配后灌胃给药。PNS高剂量按93.5 mg/kg给药，PNS低剂量按23.38 mg/kg给药（参照临床成人用量：每天360 mg/70 kg）；阳性对照药石杉碱甲按0.0386 mg/kg给药（参照临床成人用量：每天0.3 mg/70 kg）；空白对照组给与给药组相同容积的双蒸馏水灌胃。1次/d，连续给药两个月。
        2.2  免疫组织化学染色方法 快速开胸，经左心室插管，80 ml冷生理盐水冲洗后，100 ml含4％多聚甲醛PBS液灌注固定。灌注固定后，除去颅盖，取出完整大脑组织，脑组织块在上述固定液里固定4 h后，依次放入10％，20％，30％的蔗糖缓冲液（0.1 PB，pH＝7.2～7.4）中，4℃冰箱冷藏；脑组织石蜡包埋，沿针道层面附近连续冠状切片，片厚5 μm,。切片常规脱蜡水化，用PBS洗5 min×3次。切片加50μl过氧化酶阻断溶液，室温下孵育15 min， PBS洗5min×3次，用50μl 正常非免疫血清室温孵育10 min后加入50 μl 第1抗体(1：1 000)， 4℃孵育过夜。PBS洗5min×3次后加入50μl生物素标记的第2抗体，室温下孵育10 min。PBS洗5 min×3次。用50μl链霉菌抗生物素－过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min。PBS洗5min×3次。加100 μl新鲜配制DAB溶液，呈色3～10 min。自来水冲洗后用苏木素复染3～5   min。自来水洗至返蓝。常规脱水、透明，中性树胶封片。
        2.3  评价指标与统计学分析应用显微镜观察，在高倍镜下（40×）随机选取小鼠大脑顶叶皮层、海马周围白质连续5个视野，并计数5个视野APP免疫阳性细胞平均个数。结果以SPSS 11.5 for Windows 统计软件进行统计学处理，各组间差异采用单因素方差分析，同时进行Levene方差齐性检验，方差齐性资料采用F检验，各组间差异采用LSD法或SNK法比较；方差不齐资料采用近似F检验Welch或Brown-Forsythe法，并且各组间采用Dunnett"s T3或Dunnett"s C法比较。方差齐性检验水平取α=0.05，方差检验显著性水平取α＝0.05。
       3  结果
        3.1  APP免疫阳性神经元主要分布于大脑顶叶皮层、海马周围白质，神经元呈锥形、不规则形等，光镜下可见APP阳性反应物呈棕黄色，定位于胞膜或胞浆。空白组分布于大脑顶叶皮层、海马等部位有较多APP免疫阳性神经元表达。各给药组和模型组大脑顶叶皮层阳性神经元APP的表达则相对较少，免疫组化结果见图1。
        a-空白组  b-模型组  c-高剂量组  d-阳性组  e-低剂量组
        图1  APP免疫阳性神经元分布图（40×）
        3.2  APP免疫阳性细胞个数  Levene方差齐性检验显示各组方差具有齐性。经F检验，结果细胞个数F＝13.825，P＝0.000。可见各组APP免疫阳性细胞个数组间比较存在非常显著性差异（P<0.01）。各组间两两比较（LSD法）结果见表1。
        从表1可看出，空白组分别与高、低剂量组比较有非常显著性差异（P<0.01），与模型组、阳性组比较差异具有显著性（P<0.05）；高剂量组与阳性组、模型组比较亦具有非常显著性差异（P<0.01），低剂量组和模型组比较有显著性差异（P<0.05）。但阳性组和模型组比较差异并不显著（P>0.05）。故可认为空白组由于老年性痴呆模型的建立，大脑内APP阳性细胞个数明显增多，而PNS及Hup-A 对其具有较显著的保护和改善作用，高剂量PNS作用优于对照药物石杉碱甲；模型组小鼠大脑内APP含量亦低于空白组，说明随着痴呆小鼠年龄的增长APP含量也增加。表1  各组APP免疫阳性神经元相关指标各组比较
       4  讨论
        APP是β淀粉样蛋白前体蛋白，Aβ是其酶解产物。同时它又是一种由定位于21号染色体长臂上的基因编码的含有695～770个氨基酸残基的跨膜蛋白。正常情况下，APP主要是由α分泌酶与γ分泌酶共同切割，产生非致病性的片断P3，不会形成Aβ。而当编码APP的基因发生突变或其他原因导致β分泌酶活性异常增高时，APP则容易被β分泌酶与γ分泌酶共同切割产生Aβ，其Aβ分泌量可高于正常人4～10倍［4，5］。β-APP 对神经系统损伤有高度敏感性，神经元的损伤会导致 APP 免疫反应活性的增加。Kiyoshi实验发现，体外培养神经元时加入β-APP，4 d后神经元数目减至60%，同时培养基内并未测到 Aβ，证明β-APP 本身具有促神经细胞凋亡的作用［6］。但在正常情况下APP具有促进细胞增生、神经营养因子、维护突触膜稳定性、抑制丝氨酸蛋白酶活性及参与中枢神经系统免疫反应等功能［7］。
        中药三七具有散淤止痛、消肿定痛之功效。现代药理研究表明三七的有效成分三七总皂苷（PNS）具有抗炎，抗纤维化，抗脑动脉硬化，抗血栓形成的作用，在神经系统方面，PNS能限制受伤后脑神经细胞内钙超载作用，拮抗谷氨酸（Glu）介导的兴奋毒性［8］；增强免疫力、消除自由基，抗衰老作用［9］；并能增强学习与记忆［10］。实验表明，PNS对老年性痴呆动物模型大鼠的空间学习记忆损害具有明显的改善作用［11］；能明显减轻由d-半乳糖损害和鹅膏蕈氨酸损毁导致的大脑胆碱能神经元数量减少和ChAT、突触素蛋白水平降低［3，12］；同时也能显著提高老年性痴呆模型鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）水平，并能显著降低老年鼠血清胆固醇含量［9］；PNS还能增加由Aβ25-35片段神经毒性诱导的NG108-15细胞存活率，细胞突起率和细胞突起平均长度［13］。这表明了PNS在实验动物模型上能不同程度地对抗或减轻老年性痴呆样病理损害及由Aβ25-35毒性导致的损害。以上实验研究表明无论是从中医理论对老年性痴呆的辨证施治还是从现代医学治疗老年性痴呆的观点出发，PNS所显示的药理作用对治疗老年性痴呆都会有一定的疗效。
        在本实验结果中，模型组APP的含量低于空白组，说明随着痴呆小鼠年龄的增加APP的含量亦有所增加，这与文献报道是一致的［14］，同时也进一步证明我们实验的动物模型是成功的。石杉碱甲通过抑制胆碱酯酶而提高胆碱能神经末梢突触接头Ach的含量，从而相对提高中枢胆碱能神经系统的功能，对增强学习记忆及改善空间记忆障碍有一定的作用［15］，同时能对抗Aβ毒性作用，但对APP的含量未必有明显的改善和治疗作用，我们的实验结果也证实了石杉碱甲虽可减少APP的含量，但效果不如PNS高剂量组。提示石杉碱甲抗痴呆作用可能是通过抑制APP的含量而减少Aβ生成的，但对β分泌酶与γ分泌酶有无影响还需要进一步进行探讨。而PNS高、低剂量组的APP免疫阳性细胞个数则均低于空白组，差异显著，其中高剂量组尤为突出。据此可知，PNS对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑内β淀粉样蛋白的表达有一定的抑制作用，其作用机制可能是通过抑制APP的含量进而减少Aβ的生成，但对β分泌酶与γ分泌酶有无作用还需进一步研究。
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