文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的检测紫芝发酵菌体中三萜类化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的体外抑菌作用。方法杯碟法。结果紫芝三萜组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长有较明显的抑制作用，而对枯草芽孢杆菌的抑制作用相对较弱；该三萜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为30 mg/ml；而对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为60 mg/ml。此外，该三萜的抑菌成分在40℃和60℃下（处理2 h）较稳定，但在80℃和100℃温度下，热稳定性较差。结论紫芝三萜类化合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。
       【关键词】  紫芝 菌丝体 三萜 抑菌作用 最小抑菌浓度
       灵芝是十分名贵的药用真菌，在古代被称为“仙草”［1］。按照现代生物学分类，我国已知有灵芝属69种［1］。其中具有明显药理活性、应用最广泛的主要有：赤芝Ganodema Iucidum（别名红芝）、松杉灵芝Ganoderma tsugae（别名松杉树芝、铁杉灵芝）、狭长孢灵芝Ganodema lucidum、树舌灵芝Ganodema applanatum（别名树舌、平盖灵芝等）、紫芝Ganoderma sinense（又名中国灵芝，是中国灵芝的特有种类）［1］。《中国药典》规定，赤芝Ganodema 1ucidum和紫芝Ganoderma sinense为灵芝正品［2］。
        近年来，大多有关灵芝的研究主要集中在赤芝的研究方面，包括赤芝多糖、赤芝三萜的分离、药理作用、发酵技术等［3］。但有关紫芝液体发酵技术和现代药理作用的研究较少。已有研究表明，赤芝中三萜具有抑制肿瘤细胞生长、抗艾滋病病毒HIV-1、抑制真核DNA聚合酶、抑制U46619诱导的血小板凝集、止痛、镇静、解毒保肝和抗菌等功能［1,4～7］。但紫芝中子实体和发酵菌体中三萜的报道不多，本实验采用液体发酵技术获得紫芝菌丝体，从中制备了三萜类物质，研究了其对几种典型细菌生长的抑制作用。
       1  材料与方法
        1.1  菌种紫芝Ganoderma sinense由本研究室保存。
        1.2  液体菌种制备①斜面培养：菌种于28℃，在PDA斜面上培养6 d。②摇瓶培养：培养基(g/L)：蔗糖25，蛋白胨3，酵母膏2，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.2，维生素B1 0.01。
        接种后在26℃, 140 r/min下培养6 d。
        1.3  发酵菌体中三萜物质的制备  菌体冷冻干燥后，研成40目左右的粉末，用50%(V/V)乙醇回流提取4 h，离心后获得上清液，旋转蒸发器上完全去除溶剂，补适量水后，再加入适量氯仿于分液漏斗中萃取，反复萃取3次后，合并氯仿层，挥去氯仿后，用正丁醇溶解萃取物，挥去正丁醇，再用无水乙醇振荡提取后作为样品［8，9］。
        1.4  抑菌试验方法
        1.4.1  试验菌的准备将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌分别接入斜面培养基中，37℃培养18 h。再移种至营养肉汤培养基中，在37℃培养15 h，取出备用。
        1.4.2  混菌平板的制备用无菌吸管分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物，在无菌平皿中各滴加4～5滴（控制接入的细菌数为1×107），再将已溶化并冷却至45℃的琼脂培养基倒入平皿中，制成混菌平板。
        1.4.3  抑菌圈直径的测定用无菌镊子取无菌牛津杯置于混菌平板上，杯中加满试样，对照加入无水乙醇；然后将平皿放入37℃恒温箱中培养20 h，然后测量抑菌圈的直径［10～12］。
        1.5  最小抑菌浓度的确定采用连续稀释法［10,11］。
        1.6  温度对三萜抑菌活性的影响菌丝体中三萜分别经40，60，80，100℃处理2 h后，检测其抑菌活性。
       2  结果
        在体外测试了各样品在不同浓度下对3种典型细菌生长的抑制作用。添加无水乙醇的对照组没有抑菌作用；各样品组均有程度不同的抑菌作用。结果见表1。由表1可见，三萜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长有较明显的抑制作用，而对枯草芽孢杆菌的抑制作用较弱，且抑制作用与三萜的浓度成正相关。在三萜浓度为60 mg/ml，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为10.07，9.01，6.23 mm。结果表明，紫芝三萜样品对大肠杆菌的抑制作用最强。表1  紫芝菌体中三萜类物质对3种细菌生长的抑制作用表2为采用试管连续双倍稀释法测定三萜对3种细菌的最小抑菌浓度的试验结果。由表中可以看出，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在三萜浓度低于15 mg/ml时，仍然可以生长，但当三萜浓度达到30 mg/ml以上时，不再生长，说明该三萜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为30 mg/ml。而枯草芽孢杆菌在三萜浓度达到60 mg/ml时，才不能生长，因此，该三萜对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为60 mg/ml。表2  紫芝菌体中三萜化合物对3种细菌的最小抑菌浓度表3为不同温度处理（40，60，80，100℃）对三萜抑菌活性的影响。通过此实验可初步测试三萜样品抑菌成分的热稳定性。三萜样品的检测浓度为60 mg/ml。结果表明，该三萜样品经40℃和60℃处理2 h后，其抑菌圈大小与表1中60 mg/ml时的抑菌圈大小接近，无显著差异。但在80℃和100℃处理2 h后，对3种细菌的抑菌活性有所下降，其中经100℃处理后的影响最大，如对大肠杆菌的抑菌圈大小由原来的10.07 mm降到8.43 mm。在对3种细菌的抑制作用中，高温处理后，对枯草芽孢杆菌的效果影响最大，其抑菌圈大小由原来的6.23 mm降到了1.38 mm。结果说明，紫芝菌体中三萜的抑菌成分在高温下可能受到了一定程度的破坏。表3  温度对紫芝菌体中三萜成分抑菌活性的影响
       3  结论
        灵芝具有广泛的药理作用，赤芝子实体中的化学成分和药理作用已有报道，但对赤芝菌体中活性物质的药理作用研究较少，而紫芝液体培养菌丝体的药理活性研究就更少。在灵芝抑菌方面，李平作等［13］报道了赤芝菌体中灵芝酸（三萜化合物、三萜酸）对大肠杆菌、产气杆菌、肠炎杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用，结果表明灵芝酸在50 mg/ml时，对试验的4种细菌都较好的抑制作用，但没有测定对各种细菌的最小抑菌浓度。本文通过深层发酵法制备了紫芝菌丝体中的三萜，检测了其对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）、革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）以及芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌）的体外抑菌作用。结果表明，紫芝菌体中三萜类化合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均具有明显的抑制作用，但对枯草芽孢杆菌的抑制作用相对较弱；该三萜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为30 mg/ml，对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为60 mg/ml。此外，该三萜的抑菌成分在40℃和60℃下（处理2 h）较稳定，但在80℃和100℃温度下，热稳定性较差。
       【参考文献】
         ［1］ 林志彬. 灵芝的现代研究，第2版［M］.北京：北京医科大学出版社，2001：1.
       
       ［2］ 国家药典委员会. 中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2000.
       
       ［3］ Shiao M S. Natural products of the medicinal fungus Ganoderma lucidum: Occurrence, biological activities, and pharmacological functions［J］.Chemical Record, 2003, 3：172.
       
       ［4］ 刘高强，丁重阳，王晓玲. 灵芝三萜类化合物抗癌作用机制的研究进展［J］.菌物学报，2007, 26(3)：470.
       
       ［5］ EL-Mekkawy S, Meselhy MR, Nakamura N, et al. Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease substances from Ganoderma lucidum［J］.Phytochemistry 1998, 49：1651.
       
       ［6］ Mizushina Y, Takahashi N, Hanashima L, et al. Lucidenic acid O and lactone, new terpene inhibitors of eukaryotic DNA polymerases from a basidiomycete, Ganoderma lucidum［J］. Bioorg Med Chem, 1999, 7：2047.
       
       ［7］ Wang G, Zhao J, Liu JW, et al. Enhancement of IL-2 and IFN-gamma expression and NK cells activity involved in the anti-tumor effect of ganoderic acid Me in vivo［J］.International Immunopharmacology, 2007, 7(6)：864.
       
       ［8］ 王玉红，丁重阳，章克昌. 苦荞对灵芝发酵生产灵芝酸的影响［J］.食品与发酵工业, 2003, 29(9)：95.
       
       ［9］ Tang YJ, Zhong JJ. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid［J］.Enzyme and Microbial Technology, 2002, 31：20.
       
       ［10］ 黄钰铃, 王 斌. 山茱萸果肉抑菌物质的提取及抑菌作用研究［J］.食品科技, 2004,3：67.
       
       ［11］ 梁盛年 , 段志芳 , 付 莉, 等. 几种肉桂酸衍生物与肉桂酸的抑菌作用比较研究［J］. 食品科技, 2005,9：71.
       
       ［12］ 卢学根. 艾叶中抑菌物质的提取及抑菌作用研究［J］.食品科技, 2006,10：98.
       
       ［13］ 李平作，章克昌. 灵芝发酵菌丝体中灵芝酸的分离纯化及生物活性检测［J］.天然产物研究与开发，1999, 11(4)：67.