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       【摘要】 
       目的研究微切助互作技术辅助提取穿心莲内酯的最佳工艺。方法以穿心莲内酯提取率为考察指标，通过单因素及正交实验考察微切助互作技术辅助提取穿心莲内酯的主要影响因素，确定最佳工艺条件；采用高效液相色谱法测定穿心莲内酯含量。结果最佳工艺条件为：Na2CO3助剂用量3%（W/W），研磨时间为45 min （物料粒度D95 ≤44 μm），水作溶剂，料液比为1∶60（g∶ml）。该工艺条件下，穿心莲内酯提取率比热回流法提高23.2%。结论 微切助互作技术辅助提取具有提取率高、时间短、无需加热、乙醇用量少等特点，是提取穿心莲内酯的一种有效方法。
       【关键词】  微切助互作技术辅助提取； 穿心莲； 穿心莲内酯； 正交实验
       穿心莲内酯（Andrographolide）为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm.f.)Ness 的主要活性成分，现代药理研究表明其具有消炎、抗病毒、抗肿瘤、提高免疫力、保肝利胆、抗生育等药理作用。穿心莲内酯的提取方法有渗漉法［1］、浸渍法［2］、酸水法［3］、碱水法［4］及超声波提取法等［5］，存在周期长、溶剂用量大的弊端。
        微切助互作技术，是利用高强度研磨产生的机械化学效应［6］，将植物原料与化学助剂共同研磨，选用水提取有效成分的一项技术。由该技术获得的水溶性植物提取物，有效成分种类多、含量高。其基本原理是在粉碎过程中，固体植物原料颗粒团经过微切变，细胞壁破碎，细胞表面产生新鲜切面，化学助剂与有效成分之间发生基团或分子间的相互吸附或作用，改变植物有效成分的微观性能，表面能增加，比表面积增大，吸附性、极性增加，改变其溶解性而易溶于水。因此，微切助互作技术是机械化学（mechanochemistry）领域一项新的应用。机械化学最早发源于同生理机能有关的生物化学中机械运动能与化学能的转变，目前主要指通过挤压、剪切、摩擦等手段，对物质施加机械能，从而诱发其物理化学性质变化，使物质与周围环境中的固体、液体、气体发生化学变化的现象［7］。研究表明，晶体物质通过超细磨过程中的机械力作用可激活其化学活性，使通常需在高温下进行的反应能在较低温度下进行［8］。因此，机械化学作用可代替一般化学反应的加热过程甚至可以完成一般加热方法所不能达到的反应［9］。机械化学已在金属合金化［10］、有机合成［11］、化合物改性等［12，13］多个领域得到应用。研究表明，高强度研磨在破碎植物细胞的同时还能促进暴露出的有效成分与助剂接触、反应，改变成分溶解性［14～17］，如Liu等［14］采用高能振动研磨机，将Na2CO3与刺五加共同研磨，用水提取异嗪皮啶，提取率比常规法提高了16.4%。刘莹等［15］将刺五加与Na2CO3/Na2B4O7共同研磨，用水提取总黄酮，其提取率比热回流法提高13.2%。Korolev等［16］采用AGO-2型高能行星磨，将Na2CO3与西伯利亚冷杉松针共同研磨，用水提取三萜酸，提取率比常规法提高了35.9%；Lomovsky等［17］将蔗糖与伪泥胡菜共同研磨，发现该法可显著提高其中植物蜕皮类固醇在水中的溶出率，比常规法平均提高103.7%。微切助互作技术在植物提取中应用研究初步表明，该法不仅可提高有效成分的提取率，同时还实现了用水提取，具有良好的应用前景。本研究主要考察微切助互作技术辅助提取各工艺条件对穿心莲内酯提取率的影响，通过正交实验优化提取工艺，并与热回流提取对比。
       1  仪器与材料
        1.1  仪器 WZJ(BFM)-6J振动研磨机（济南倍力粉技术工程有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪-分析（美国Agilent公司）；LC-10高效液相色谱仪-制备（大连江申分离科学技术公司）；FD-ID冷冻干燥机（北京博医康仪器有限公司）；标准分样筛（河南新乡康达新机械有限公司）；LS100Q激光粒度仪（美国Beckman Coulter公司）；JEM-1200Ex扫描电镜(日本电子株式会社)；质谱分析仪（美国HP公司）。
        1.2  材料 穿心莲根及根茎（购自大连开发区大药房，产地福建）；穿心莲内酯标准品（中国药品生物制品检定所）；其余试剂均为分析纯。
       2  方法
        2.1  微切助互作技术辅助提取
        2.1.1  穿心莲粉末的粒度及形态分析采用激光粒度仪分析微切助互作技术处理后穿心莲细粉（Na2CO3用量，4%；D95 ≤44 μm）的粒度分布；采用扫描电镜(Scanning Electron Microscope, SEM)观察穿心莲粗粉、超微粉碎(D95 ≤44 μm)及微切助互作技术处理后穿心莲细粉（Na2CO3用量，4%，W/W；D95 ≤44 μm）的形态，其中粗粉放大倍数为600倍，超微粉碎及微切助互作技术处理后的穿心莲细粉放大倍数为2 000倍；加速电压均为40 kV。
        2.1.2  助剂的选择 非极性的穿心莲内酯在碱溶液中，酯环开环，加酸调节pH值至中性后又重新闭环，成为原来的内酯，在常规操作中常采用碱提酸沉的方法进行提取。根据上述性质，本研究用Na2CO3，NaOH或NaHCO3为助剂分别与穿心莲共同研磨。
        2.1.3  供试品溶液制备 用小型中药粉碎机将穿心莲药材粉碎至60目，60 ℃下干燥3 h备用（即粗粉，以下同）。取粗粉200 g与一定量Na2CO3混合研磨。精确称取研磨后的粉末5.0 g（按生药计），加入一定量溶剂，室温（20 ± 3 ）℃搅拌一段时间，离心，取上清液，沉淀重复提取2次，合并上清液，用稀盐酸调节pH值为3.0，静置过夜，离心，取沉淀，干燥并研碎后加入20 ml 95%乙醇，超声充分溶解，过滤，用乙醇定容滤液至100ml,得供试样品。提取工艺如图1所示。
        图1  微切助互作技术辅助提取工艺
        2.1.4  单因素实验 分别考察助剂用量、研磨时间、乙醇浓度及料液比对微切助互作技术辅助提取穿心莲内酯的提取率的影响。助剂用量（占总物料干重）采用1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%（W/W），7个水平；研磨时间采用10%，20%，30%，40%，50%，60% 6个水平；乙醇浓度采用0%（水），20%，40%，60%，80%（V/V），5个水平；料液比采用1∶10，1∶30，1∶50，1∶70，1∶100（g∶ml），5个水平。试验条件：Na2CO3用量4%（占总物料干重），粒度D95 ≤44 μm，水作溶剂，料液比1:50（g:ml），搅拌10 min。在其他条件不变的情况下，改变其中一个因素探讨其对穿心莲内酯提取率的影响。
        2.1.5  正交实验 根据单因素试验结果，作L9(34)正交设计，因素水平表见表1。表1  正交设计因素水平表
        2.2  其他提取方法供试品溶液的制备
        2.2.1  超微粉碎辅助提取 取穿心莲粗粉200 g研磨至粒度D95 ≤44 μm。精确称取研磨后的粉末5.0 g，加入250 ml，75%乙醇，室温（20 ± 3 ）℃搅拌10 min，离心，取上清液，沉淀重复提取2次，合并上清液并浓缩，得浸膏，真空干燥，研碎后加入20 ml，95%乙醇，超声充分溶解，过滤，用乙醇定容至100 ml，得作供试品溶液。
        2.2.2  物理混合样品的提取 取超微粉碎后的穿心莲粉5 g（D95 ≤44 μm）与0.192 g Na2CO3（占总物料干重的4%，粒度D95 ≤44 μm）均匀混合，直接提取，过程同“2.2.1”项。
        2.2.3  热回流提取 精确称取穿心莲粗粉5.0 g，用250 ml，75%乙醇回流2 h，离心，取上清液，沉淀重复提取两次，合并上清液并浓缩，得浸膏，真空干燥，研碎后加入20 ml，95%乙醇，超声充分溶解，过滤，用乙醇定容至100 ml，得供试品溶液。
        2.3  含量测定
        2.3.1  标准曲线的建立 精密称取120 ℃减压干燥至恒重的穿心莲内酯对照品10 mg置10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1 ml至10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液(0.1 mg/ml)。分别精密进样2，4，8，12，16，20 μl，得色谱峰的峰面积积分值Y与进样量X (μg)呈良好的线性关系，线性回归方程为Y = 3 282.1X - 274.9，相关系数r2=0.999 4。
        2.3.2  色谱条件及供试品测定 EPS C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；甲醇-水溶液(65∶35, V/V)流动相；检测波长为225 nm；时间30 min；流速1 ml/min；进样量10 μl。分别进样测定穿心莲药材中穿心莲内酯的含量，与标准曲线对照得穿心莲内酯质量，提取率按下式计算：
        E（%） = m/M × 100%；
        E—— 提取率；
        m——经换算后提取液中穿心莲内酯质量(mg)；
        M——穿心莲样品质量(mg)。
        2.3.3  精密度实验 精确量取同一供试品溶液5份，按上述方法分别测定穿心莲内酯，RSD为0.63%，表明该检测方法精密度良好。
        2.3.4  回收率实验 精确量取已知含量的供试品溶液5份各1 ml，分别加入0.2 ml标准品溶液，按“2.3.2”项方法分别测定穿心莲内酯含量，回收率均在93.2%～98.2%之间，平均回收率94.8%，RSD为0.67%。
        2.4  质谱分析 利用半制备液相色谱分离出目标提取物，浓缩，再进行质谱分析。液相色谱条件：色谱柱为Shimpeck VP-ODS（2.0 mm × 15 cm）；流动相为甲醇-水（65∶35，V/V）；检测波长225 nm；流速0.2 ml/min；进样量2 μl。质谱分析：ESI离子源。
        2.5  统计学方法 实验数据采用±s表示，用SPSS 10.0统计软件单因素方差分析，S-N-K检验处理。
       3  结果
        3.1  助剂的筛选以穿心莲内酯提取率为指标，考察不同助剂的提取效果，如表2所示。3种不同碱助剂比较，以Na2CO3的提取率效果最好，提取率显著高于其它两组及超微粉碎辅助提取(P<0.05)。NaOH作助剂时提取率较Na2CO3低(P<0.05)，这可能是由于NaOH的碱性较强，会增加杂质溶出量，从而影响穿心莲内酯的溶出；以NaHCO3为助剂的提取率也低于Na2CO3（P<0.05），因为NaHCO3的碱性偏低，在本实验条件下可能未与穿心莲内酯充分作用。表2  不同助剂对穿心莲内酯提取率的影响根据上述分析结果，选用Na2CO3作为微切助互作技术辅助提取穿心莲内酯的最佳助剂。
        3.2  穿心莲粉末的粒度及形态分析常规中草药细胞的尺寸一般在10～150 μm范围内。激光粒度仪分析表明，经微切助互作技术处理后，D95 ≤44 μm的穿心莲细粉（Na2CO3用量为3%），物料粒径D70 ≤22 μm，D20≤10 μm，提示大部分细胞可能被完全破碎。电镜分析结果如图2所示，过60目筛的穿心莲粗粉A(CON)在放大600×的电镜下仍可观察到较完整的植物组织结构，大部分细胞未被破碎。而经超微粉碎B(M)和微切助互作技术C(MC)处理后，在放大2 000×的电镜下已观察不到完整细胞，提示研磨到粒度D95≤44 μm，穿心莲药材细胞可能已被充分破碎，细胞内的成分被暴露出来，呈释放状态。
        A(CON)，穿心莲粗粉，过60目筛；
        B(M)，超微粉碎后的穿心莲粉末(D95 ≤44 μm)；
        C(MC)，微切助互作技术处理后穿心莲粉末(D95 ≤44 μm，Na2CO3用量，
        4%)
        图2  不同预处理后穿心莲粉末的电镜照片
        3.3  不同预处理方法对穿心莲内酯提取率的影响见表3。表3  不同预处理方法对穿心莲内酯提取率的影响穿心莲与Na2CO3共同研磨后以水为溶剂的提取率比超微粉碎（75%乙醇作溶剂）提高16.54%（P<0.05）。物理混合样品的助剂用量、物料粒度、溶剂等条件均与微切助互作技术相同，但穿心莲内酯提取率却显著低于后者（P<0.05），这表明机械研磨在促进Na2CO3与内酯类物质的接触、反应，提高穿心莲内酯水溶性方面可能起到重要作用。
        3.4  单因素实验
        3.4.1  助剂用量对提取率的影响 见图3。
        图3  Na2CO3用量对穿心莲内酯提取率的影响
        助剂的最小用量主要取决于微切助互作技术辅助提取过程中的传质速率及目标提取物的性质，如提取松针三萜酸时，为使三萜酸与碱充分作用，Na2CO3的最小用量为3%（W/W）［16］。由本实验结果可知，当Na2CO3用量大于2.5%（W/W）后，穿心莲内酯的提取率趋于平衡（P>0.05）。这表明在本实验条件下，添加2.5% Na2CO3即可使穿心莲内酯与碱充分作用。
        3.4.2  研磨时间对提取率的影响 见图4。
        图4  研磨时间对穿心莲内酯提取率的影响
        随研磨时间延长，物料粒度减小，助剂与目标提取物接触、作用时间越长。粒度由D95 ≤125 μm（研磨时间为10 min）减小至44 μm（研磨时间为40 min），穿心莲内酯的提取率提高了39%（P<0.05）。当粒度D95 ≤44 μm后，提取率无显著提高（P>0.05）。故研磨时间选用40 min，即物料粒度D95≤44 μm。
        3.4.3  乙醇浓度对提取率的影响 见图5。
        图5  乙醇浓度对穿心莲内酯提取率的影响
        由图5可知，穿心莲粗粉和超微粉碎的细粉在60及80%乙醇中提取率较高，水作溶剂时的提取率较低（P<0.05）。微切助互作技术处理后，穿心莲内酯在水中的提取率最高，且好于其他样品在不同溶剂中的提取率，随乙醇浓度增加，提取率逐渐降低（P<0.05）。这表明微切助互作技术可提高穿心莲内酯在极性溶剂中的溶解性，进而可用水提取。
        3.4.4  料液比对提取率的影响 见图6。
        图6  料液比穿心莲内酯提取率的影响
        随溶剂用量增大，穿心莲内酯提取率增加，当料液比小于1:50（g:ml）后，提取率增加幅度不明显（P>0.05），考虑生产成本和后续处理，料液比取1∶50（g∶ml）。
        3.5  正交实验 根据以上单因素实验的结果，选择L9(34)表，实验方案及计算结果见表4（搅拌提取10 min）。
        由级差分析可知，微切助互作技术辅助提取穿心莲内酯的最佳工艺为A3B3C1D3，即Na2CO3助剂用量为3%（W/W），研磨时间45 min，水作为溶剂，料液比为1∶60（g:ml）。各因素对提取率的影响次序为：乙醇浓度 > 物料粒度 > 助剂用量 > 料液比。    在优化的工艺条件下进行了3批原料的平行提取，提取率分别为1.597%，1.603%，1.585%，平均提取率为1.595%。表4  L9(34)正交实验结果
        3.6  微切助互作技术辅助提取与热回流提取对比按正交实验确定的最佳工艺条件提取穿心莲内酯，与热回流提取对比，见表5。表5  微切助互作技术辅助提取与热回流提取对比
        微切助互作技术的提取率比热回流提取高23.2%，室温下操作，提取时间由120 min缩短到10 min，且以20%（V/V）稀醇作溶剂，减少了乙醇用量。
        经液相色谱分离出的提取物纯度为91%（液相色谱峰面积百分比）。质谱分析结果如图7所示。检测到正模式［M+Na］+(m/z 373.3)及负模式［M+Cl］-(m/z 385.3)峰(质谱仪误差为±0.5)，说明该物质的分子量为m = 350，与穿心莲内酯标准品的分子量(m = 350)一致。这表明穿心莲内酯分子在提取过程中可能未发生变化。
        图7  微切助互作技术辅助提取穿心莲内酯提取物的质谱分析4  讨论
        本研究将微切助互作技术用于穿心莲内酯的提取，最佳工艺条件为Na2CO3助剂用量为3%（W/W），研磨时间45 min，水作为溶剂，料液比1∶60（g∶ml）。该工艺条件下与热回流提取比较，微切助互作技术辅助提取在室温下以水作为溶剂，穿心莲内酯提取率比热回流提高23.2%，且大大缩短提取时间，操作简便，是提取穿心莲内酯的一种有效方法。本研究为微切助互作技术在中药提取中的应用提供了参考。
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