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       【摘要】 
       目的研究复方银黄微型灌肠剂（Yinhuang Micro-enema Compound，YHMEC）含药血清对大鼠腹腔巨噬细胞（PMФ）分泌肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的影响。方法将大鼠随机分成3组，分别于末次灌肠给药后10，30，60 min采集含药血清，采用MTT比色法检测不同采血时间的含药血清对PMФ活力的影响；细胞培养上清液中TNF-α，IL-6的表达采用ELISA法检测。结果末次给药后30，60 min采集的含药血清对PMФ的活力及细胞因子的表达影响显著（P<0.05或P<0.01）。结论复方银黄微型灌肠剂含药血清能显著抑制LPS诱导的TNF-α，IL-6表达，具有明显的体外抗炎活性。
       【关键词】  复方银黄微型灌肠剂 血清药理学； 巨噬细胞 肿瘤坏死因子 白细胞介素6
       肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）是重要的炎症介质，参与许多炎症反应［1］，脂多糖（LPS）可诱导大鼠腹腔巨噬细胞（PMФ）分泌TNF-α，IL-6明显增强［2，3］。复方银黄微型灌肠剂（Yinhuang Micro-enema，YHMEC）是由金银花、黄芩、柴胡等中药精制而成的纯中药制剂，具有清热、解毒、消炎等功效［4］。本实验主要通过研究YHMEC含药血清对PMФ的活力的影响及对由LPS诱导PMФ分泌TNF-α、IL-6的影响，探索中药微型灌肠剂血清药理学的实验方法。
       1  器材与方法
        1.1  材料与仪器YHMEC，由广西中医药研究所提供；脂多糖（LPS），购自美国Sigma公司产品；二甲基噻唑二苯基四唑溴蓝（MTT），美国Sigma公司产品；胎牛血清（FCS），杭州四季清公司；RPMI1640细胞培养基，美国Gibco公司产品；大鼠TNFα、IL6 ELISA试剂盒，晶美生物工程有限公司产品；联免疫检测仪(BioBad，model450)。
        1.2  YHMEC含药血清的制备健康SD大鼠32只，体重220～250 g，♀♂各半。将大鼠随机分成4组，分别为A，B，C，D组，每组8只，其中B，C，D组灌肠给药YHMEC 8 ml/kg，A组给予相同剂量的生理盐水，2次/d，连续给药3 d。A，B，C，D组分别于末次给药后30，10，30，60 min行腹主动脉采血。待血液充分凝固后，2500 r·min-1离心分离血清，血清呈透明、淡黄色，未溶血。将同组血清充分混匀后0.22 μm过滤除菌，于-20℃保存，1个月内使用。
        1.3  PMФ的分离、提纯和培养参考文献［5］并稍作修改，乙醚麻醉健康SD大鼠，体重250～300 g，♀♂不拘，颈椎脱臼处死。将预冷至4℃的RPMI1640培养液注入腹腔，无菌条件下抽取腹腔液，800 r·min-1离心5 min，于5%CO2培养箱培养1 h后用Hanks液洗去未贴壁细胞3次，再培养1 h后换液，2.5 g·L-1胰酶消化，含10% FCS的RPMI1640培养液重悬细胞，调细胞密度为2×106·ml-1，台盼蓝染色证明细胞活力>99%，于5%CO2培养箱继续培养。
        1.4  检测指标及方法
        1.4.1  YHMEC含药血清对PMФ活力的影响各实验组分为①正常对照组：10%FCS常规培养；② LPS组：予0.1 mg·L -1LPS刺激；③YHMEC含药血清+LPS组：分为16个亚组，即予0.1 mg·L -1LPS刺激，5%，10%，20%，40%的A，B，C，D组YHMEC含药血清培养。每组设5个复孔，孵育72 h后用酶标分析仪测定570 nm处各组光密度（OD）值，间接反应活细胞数量。
        1.4.2  PMФ分泌TNF-α，IL-6的浓度测定各实验组分为①正常对照组：10%大鼠空白组（A组）血清培养；②LPS组：予0.1 mg·L-1LPS刺激，10%大鼠空白血清培养；③LPS+B组，予10 mg·L-1  LPS刺激，10%B组血清培养；④LPS+C组：予0.1 mg·L-1LPS刺激，10%C组血清培养；⑤LPS+D组：予0.1 mg·L-1LPS刺激，10%D组血清培养。于刺激3，12 h后留取细胞培养上清分别用于检测TNF-α，IL-6的蛋白表达，各组每个时间点取5个复孔。ELISA法检测TNF-α，IL-6含量按ELISA试剂盒操作说明书进行。
        1.5  统计学处理计量资料均以±s表示，用SPSS12.0统计软件进行方差分析。
       2  结果
        2.1  YHMEC含药血清对PMФ活力的影响
        2.1.1  不同浓度的空白血清影响PMФ活力的比较PMФ经LPS诱导，由静止性细胞成为有吞噬活力的炎性巨噬细胞。 为了解大鼠空白血清本身对PMФ活性的影响，以用于细胞常规培养的10%的FCS作对照，观察了不同浓度的大鼠空白血清对PMФ生长活性的影响。实验结果（见表1）表明，随着大鼠空白血清浓度增加，OD值也呈明显的增长趋势，培养72 h后活细胞的数量与对照组相比也有明显的提高，提高率（%）=（大鼠血清组OD值/对照组OD值-1）×100%。提示与FCS相比，大鼠空白血清对大鼠PMФ的活性更有促进作用。
        2.1.2   含药血清对PMФ活力的影响与同浓度的空白血清+LPS组比较，末次给药后30，60 min采血所得的含药血清，当血清添加量为10%，20%，40%时均有显著差异（P<0.05），而末次给药后10 min采血所得的含药血清，当血清添加量为5%，10%，20%，40%时均无显著差异（P>0.05），且当血清添加量为5%时，末次给药后10，30，60 min采血所得的含药血清均无显著差异（P>0.05）。见表2。可见含药血清的体外抗炎效果与血清添加量及采血时间有关。表1  大鼠空白血清对PMФ生长活性的影响 表2  各组血清作用于PMФ72 h后OD值的比较与相同浓度的空白血清+LPS组比较，*P<0.05，**P<0.01；n=5
        2.2  YHMEC含药血清对LPS诱导PMФ分泌TNF-α，IL-6的调节作用与正常对照组比较，LPS组TNF-α，IL-6含量显著增加，LPS+C，D组 TNF-α，IL-6含量比LPS组明显减少（见表3）。提示LPS可以诱导PMФ分泌TNF-α，IL-6明显增强，而末次给药后30，60 min浓度为10%的含药血清能显著抑制TNF-α，IL-6的蛋白表达。表3  各组PMФ培养上清TNF-α，IL-6含量的比较与LPS组比较，*P<0.05，**P<0.01
       3  讨论
        复方银黄微型灌肠剂是根据传统中医理论和临床经验设计的直肠给药新剂型。方中的君药是金银花和黄芩。现代研究表明，金银花对多种细菌均有较好的抑菌作用；黄芩不但能抗菌、镇静、降压、降低毛细血管通透性，而且还具有利胆、抗炎和抗变态反应的作用［4］。该药为微型灌肠剂具有用量小、起效快的优点，能取得与静脉注射相似的吸收效果，尤其适用于不宜口服和静脉给药的患者。
        可能是由于血清同源性的影响，不同浓度的大鼠空白血清与10%FCS常规培养相比，大鼠空白血清对大鼠PMФ的活性更有促进作用且有明显的浓度依赖性。因此实验中设计了同浓度的空白血清作对照，以排除大鼠血清本身对观察指标的干扰。从实验结果可以看出，同浓度的各含药血清组与LPS组比较，以C、D组抗炎效果较为显著（P<0.05 或P<0.01），而5%，10%，20%，40%的B组血清均未呈现明显的体外抗炎效果（P>0.05）。笔者分析，可能是因为末次给药后30，60 min采血，药物在直肠停留时间较长，药物吸收时间相对延长，因此C，D组血清比B组血清中血药浓度要高些。可见，通过直肠给药方式采集含药血清，于末次给药后60 min采血效果较佳。
        血清药理学实验方法由于能克服中药粗提物尤其是中药复方中复杂成分对体外实验的干扰，不但能反映中药（母体药物）及其可能的代谢产物的药理（效）作用，而且还能反映有可能由药物诱导机体内源性成分所产生的作用［6］，在体外实验中能更好地反应药物经体内代谢后的实际作用。以往有关血清药理学实验方法的文献报道中，实验动物多以口服（灌胃）方式给药，而有关微型灌肠剂的血清药理学的报道极少。本研究初步探讨了YHMEC经灌肠给药后，不同采血时间及含药血清的不同浓度对实验结果的影响，为血清药理学的实验方法提供一条新思路。
       【参考文献】
         ［1］ Blackwell TS, Christman JW. The role of nuclear factor-kappa B in cytokine gene regulation［J］.Am J Respir Cell Mol Biol.，1997,17 (1): 3.
       
       ［2］ Shackelford RE, Alford PB, Xue Y et al .Aspirin inhibits tumor necrosis factor alpha gene expression in murine tissue macrophages［J］.Mol Pharmacol. 1997, 52 (3): 421.
       
       ［3］ Prakash H, Ali A, Bala M et al. Anti-inflammatory effects of Podophyllum hexandrum (RP-1) against lipopolysaccharides induced inflammation in mice［J］.J Pharm Pharm Sci. 2005, 8 (1): 107.
       
       ［4］ 刘华钢，陈燕军，姚树汉. 复方银黄灌肠剂抗炎作用的研究［J］.广西医科大学学报，1999, 16 (6)：750.
       
       ［5］ 章静波. 组织和细胞培养技术［M］.北京：人民卫生出版社，2002：85.
       
       ［6］ 王宁生，雷 燕，刘 平，等. 关于血清药理学的若干思考［J］.中国中西医结合杂志，1999，19（5）：263.