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       【摘要】 
       目的分析当归补血汤的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇部位的特征峰在复方全方及在单味药中的归属。方法采用高效液相色谱法，色谱柱为Shim-Pack VP-ODS柱，250 mm×4.6 mm I.D.，流动相为甲醇-水（梯度洗脱），检测波长为280 nm，流速为1 ml/min。结果复方石油醚部位的9个特征峰5个来自当归,4个来自黄芪；氯仿部位的9个特征峰6个来自黄芪，3个来自当归；醋酸乙酯部位的11个特征峰，7个同时来自当归和黄芪，1个来自当归，3个来自黄芪；正丁醇部位的7个特征峰，6个同时来自于当归和黄芪,1个来自黄芪。结论复方各部位的指纹图谱为阐明各部位的药效物质基础提供科学依据，为下一步的临床应用以及新药的开发提供参考。
       【关键词】  当归补血汤 单味药 有效部位 指纹图谱 高效液相色谱
       中药有效部位可以在保留原方治疗优点的基础上提高中药的作用强度、临床药效以及质量控制水平，改变传统中药大、黑、粗外观形象，是中药研究的又一新的发展点［1］，是研发中药二类新药依据［2，3］，也是从中药开发新药的第3条途径［4］。王明军等［5］论述了中药有效部位研究的现状、方法和手段，并阐明用中药指纹图谱对中药提取物进行质量控制。
        当归补血汤为中医经典名方之一，始载于李东垣的《内外伤辨惑论》,按黄芪∶当归= 5∶1 组成，具有补气生血等功效。对该复方的HPLC及GCMS实验研究表明当归补血汤成分极其复杂［6，7］；根据模型不同，不同部位可用于不同疾病的治疗［8，9］，对该复方某部位指纹图谱的研究也有报道［10～12］。为获得当归补血汤各部位更全面的信息，本文建立了当归补血汤的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇部位的指纹图谱，并找到了这些部位的特征峰在复方全方及在单味药中的归属,为各部位的药效物质基础的阐明提供科学依据。
       1  仪器与试药
        Agilent 1100系列高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；G1315A型二极管阵列检测器。当归购自甘肃岷县，黄芪购自长沙九之堂药店，经湖南省中医药研究院中药研究所鉴定。阿魏酸与芒柄花素对照品（中国药品生物制品检定所提供），甲醇为色谱纯,水为二次去离子水，其余试剂为分析纯。
       2  方法与结果
        2.1  色谱条件ShimPack VPODS柱，4.6 mm×250 mm I.D. ，流动相组成：A相（H2O）和B相（CH3OH），B相的体积分数在0～10 min为1 %～25 %，10～20 min为25%～50%，20～30 min为50%～70%，30～50 min为70%～90%；流速1.0 ml/min；柱温为室温25 ℃；检测波长280 nm。
        2.2  供试品溶液的制备
        2.2.1  当归补血汤复方全方的制备称取黄芪和当归粉末（过40目筛）各8 g，1.6 g，加8倍量和6倍量70%的乙醇，分别回流提取2 h和1 h，将所得醇提物蒸干，残渣加甲醇溶解定容到25 ml。
        2.2.2  当归补血汤复方及单味药各有效部位的提取
        复方有效部位的提取：分别称取黄芪和当归粉末（过40目筛）各20，4 g，加8倍量和6倍量70%的乙醇，分别回流提取2 h和1 h，将所得醇提物蒸干，残渣均匀分散于48 ml水中，使其含量为0.5 g药材/ml，水溶液依次用同体积石油醚、氯仿、醋酸乙酯，正丁醇各萃取3次，各部位提取液蒸干，残渣加甲醇溶解定容到10 ml，即为复方的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇部位。
        单味药的有效部位的提取：分别称取黄芪、当归粉末（过40目筛）各20，4 g，同法操作，制备单味药黄芪，当归的相应部位。
        2.3  精密度实验取“2.2.1”项下样品20 μl，按拟定方法连续进样6次，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，所得相似度为0.997 5，0.996 2，0.997 6，0.995 1，0.988 0，0.997 5，相似度极高，说明供试品进样精密度良好。
        2.4  重复性实验按“2.2.1”项下方法，平行实验5次，分别取20 μl，按拟定方法进样，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，所得相似度为0.954 2，0.993 2，0.995 8，0.994 3，0.991 1，相似度极高，说明方法的重复性良好。
        2.5  稳定性实验取同一复方供试液20 μl分别在0，6，12，24，48 h 进样5次的，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，所得相似度为0.982 0，0.992 9，0.983 8，0.996 7，0.994 2，相似度极高，说明48 h内供试品溶液稳定性较好。结果表明样品指纹图谱各色谱峰相对迁移时间和峰面积基本一致，相似度较高，符合指纹图谱研究的技术要求。
        2.6  供试品溶液的检测取上述样品各20 μl，分别进样，阿魏酸、芒柄花素、复方全方及复方单味药各部位的HPLC指纹图谱见图1～6。主要特征峰峰面积百分含量见表1。表1  样品主要特征峰峰面积相对百分含量
       3  讨论
        从图2可以看出复方成分复杂，对响应值较大的21个峰编号分析，经阿魏酸与芒柄花素标准品（浓度均为500 μg/ml）对照，确认峰7为当归中阿魏酸，峰18为黄芪中芒柄花素。此外，通过解析得到的光谱与文献［13，14］对照（王平《黄芪当归复方的指纹图谱及对兔肝纤维化的药理药效研究》 中南大学中药现代化研究中心），对另外5个峰初步定性为：峰9：毛蕊异黄酮苷；峰14：毛蕊异黄酮；峰16：（3R)-7,2"-Dihydroxy-3", 4"-dimethoxyisoflavan;  峰19：Z-藁苯内酯；峰20：E-藁苯内酯。
        3.1  对复方及单味药的石油醚部位的谱图分析从图3中可以看出复方的石油醚部位的9个特征峰，4个来自黄芪，5个来自当归，即峰14，15，16，18来自黄芪，峰22，17，19，20，21来自当归，以20号峰（当归中E-藁苯内酯）峰值最大为主要特征，从表1看出其峰面积百分含量为54.61%，表明该部位提取出的是极性很小的脂溶性物质。该部位中峰22在复方全方中没找到，可能是由于浓度原因：提取复方全方时，取9.6 g药材提取液蒸干后，为保证残渣的完全溶解，用甲醇溶解定容到25 ml；而在提取有效部位时，取24 克药材提取蒸干，石油醚萃取残渣水溶液后，石油醚液蒸干，残渣用甲醇溶解定容到10 ml，依此计算石油醚部位浓度是全方的6.25倍，浓度的增大使复方全方中没检测到的峰22在石油醚部位中出现。
        3.2  对复方及单味药的氯仿部位的谱图分析从图4可以看出，复方氯仿部位的9个特征峰，6个来自黄芪，3个来自当归，即峰3，9，14，15，16，18来自黄芪，峰7，11，12来自当归。从表1中看出该部位是14号峰（黄芪中毛蕊异黄酮）和18号峰（黄芪中芒柄花素）峰值最大的部位，峰面积百分含量分别为41.19%和14.58%，表明该部位提取出的主要是黄芪中的黄酮类，异黄酮类物质，以黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素峰值较高为主要特征。
        3.3  复方及单味药中醋酸乙酯部位的谱图分析从图5可以看出，复方该部位的11个峰，7个同时来自当归和黄芪，1个来自当归，3个来自黄芪，即峰2,3,5,11,12,13,21同时来自当归和黄芪，峰7来自当归，峰9,14,18来自黄芪，以7号峰（当归中阿魏酸）峰值最大为主要特征，其峰面积百分含量为30.3%。复方醋酸乙酯部位中峰18（芒柄花素）在黄芪中的该部位中没有找到，可能是黄芪中的成分比复方少很多，单味药黄芪中芒柄花素在用氯仿提取时已完全提取出，而复方中成分较多，或者复方中其他组分的影响不利于芒柄花素的提取，用氯仿没有完全提取出，因而在复方醋酸乙酯部位中还有少量。同时当归中峰20即E-藁苯内酯在复方醋酸乙酯部位中没有，却有少量在当归此部位，可能是黄芪中的某组分能促进E-藁苯内酯的提取，使其在复方的氯仿部位中已完全提取出，因而在复方醋酸乙酯部位中没有出现。
        3.4  复方及单味药中正丁醇部位的谱图分析为了清楚地显示该部位的峰，取色谱峰流出的时间段，如图5所示，该部位提取的物质除峰9，14外，其余物质集中在保留时间段0～15 min流出,表明该部位提取的主要是极性较强的物质，以2号峰峰值最大为主要特征，其峰面积百分含量为31.38%。该部位主要有7个峰，6个同时来自当归和黄芪，1个峰来自黄芪，即峰1,2,3,4,5,6同时来自于当归和黄芪,峰9来自黄芪，在黄芪的正丁醇部位峰14即毛蕊异黄酮,在复方中该部位中没有，原因可能类似于“3.3”中E-藁苯内酯的溶出情况。
        从表1可以看出，当归中阿魏酸在复方全方，复方氯仿，复方醋酸乙酯部位中均存在，其含量分别为7.76%,16.96%,30.3%，石油醚及正丁醇部位中却没有，判断阿魏酸肯定不溶于石油醚，用氯仿萃取时，可能由于阿魏酸在氯仿中的溶解度较小，或者复方其他物质的影响，不利于阿魏酸的完全溶出，即使用同体积的氯仿萃取了3次还是没能把它完全提取出，醋酸乙酯萃取时，该物质完全萃取出了。表明阿魏酸主要集中在醋酸乙酯部位，该部位则是与阿魏酸药效最相关的部位。除了阿魏酸还有其他物质出现在不同的有效部位，其含量却有较大差别，这种现象可能是由于用有机试剂萃取全方时难以完全把该物质萃取出，或者有机试剂之间有影响，同一物质能溶于所选的不同试剂，但溶解情况有较大差异，不同部位提取出的主要物质不同，将有不同的临床疗效。
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