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       【摘要】 
       目的探讨草苁蓉提取物对β淀粉样肽（β-AP）所致阿尔茨海默病(AD)模型大鼠的脑内巢蛋白（Nestin）表达的影响，并对其保护作用提供理论依据。方法取健康的SD大鼠60只，随机分为正常组、假手术组、模型组和草苁蓉提取物高、中、低剂量组。用Aβ1～40微量注射至大鼠双侧Meynert基底核，建立AD模型，用草苁蓉提取物进行治疗，于治疗后用Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力，用免疫组化染色法检测Nestin阳性神经细胞数的表达。结果各治疗组的逃避潜伏期较模型组明显缩短，大鼠在原平台象限游泳时间占整个游泳时间的百分比显著升高，穿过原平台所在位置的次数明显增加（P<0.01）。草苁蓉提取物高剂量组大鼠海马区Nestin阳性神经元数量在治疗组中表达最强，与模型组相比，具有显著性差异（P<0.01）。结论 草苁蓉提取物能增强AD模型大鼠海马神经干细胞Nestin的表达，提高AD大鼠的学习记忆能力，其机制尚需进一步研究。
       【关键词】  草苁蓉 阿尔茨海默病模型 巢蛋白
       阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是发生在早老及老年期、不可逆转的、渐进性的、以精神行为异常为主的脑变性疾病。其特征性病理标志为脑内细胞外存在大量由淀粉样β蛋白（beta-awyloid protein,Aβ）组成的老年斑，神经元缠结（NFTs）及皮质、海马选择性神经元变性和缺失。其中海马病变早于皮质，在疾病早期海马区神经元便明显减少［1］。研究认为，神经毒性物质Aβ在脑中广泛沉积，在AD发病中起中心作用，能引发神经元退化和凋亡等诸多病理过程，最后引起痴呆［2］。草苁蓉为列当科寄生草本植物，具有很高的药用价值，近年来文献报道，草苁蓉具有抗炎、抗缺氧、抗疲劳、促进记忆及增强免疫功能等效用。本实验通过双侧Meynert基底核微量注射凝聚态Aβ1～40建立AD模型，观察草苁蓉提取物对AD模型大鼠学习记忆能力的影响及其脑内巢蛋白（Nestin）表达规律。
       1  材料
        取SD大鼠60只，体重200～250   g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。WDT-Ⅱ微电极推进器脑立体定位仪（国营西北光化学仪器厂）、Morris水电迷宫（中国医学科学院药物研究所）。Aβ1～40，Nestin一抗（美国Biosource公司），DAB、即用型SABC染色试剂盒（武汉博士德），1∶6草苁蓉提取物（江汉大学医学院提供）。Aβ孵育：Aβ1～40加入0.1％三氟乙酸后放入38℃水浴恒温箱孵育48 h，使其成为凝聚状态备用。
       2  方法
        2.1  分组与处理对照组为正常组及假手术组：正常组，不进行任何处理及治疗，每组10只；假手术组注射等量生理盐水，手术方法见“2.2”项下方法，每组10只。将造模成功的动物随机分为模型组，中药组。模型组，10只，造模成功后，不进行任何治疗。中药组，30只，低剂量组给予每只大鼠中药草苁蓉的提取物1  ml(折合生药0.03 g/ml)灌胃，中剂量组给予每只大鼠中药草苁蓉的提取物2 ml灌胃，高剂量组给予每只大鼠中药草苁蓉的提取物4 ml灌胃，每组10只，连续28 d。
        2.2  动物模型的制作大鼠在10%水合氯醛380 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪。脑立体定位仪固定平颅头位切开皮肤及皮下组织，用棉签蘸取少量双氧水轻拭颅骨表面，清除泡沫能清晰显现前囟，参照大鼠脑立体定位图谱，以前囟为原点，向后1.4 mm，旁开3.0 mm为穿刺点转穿颅，自脑表面进针7.0 mm分别至双侧Meynert基底核，用微量注射器将聚集状态的Aβ1～40各1    μl（5 μg）在2 min内缓慢注入，留针10 min，以使Aβ1～40充分浸润局部组织，注射完毕后将微量注射器在7 min内缓慢抽出。假手术组注射等量的生理盐水。所有操作均在无菌条件下进行，术后每只大鼠腹腔注射青霉素1万单位，缝合切口，常规饲养。
        2.3  学习记忆观察治疗后进行Morris水迷宫训练，首先进行定位航行试验，历时3 d，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间，即逃避潜伏期。如果大鼠在120 s内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期为120 s。然后于第4天撤除平台进行空间探索试验，任选1个入水点将大鼠放入水池中，考察大鼠对原平台的记忆，记录其穿过原平台所在位置的次数及在原平台象限的游泳时间和距离。训练期间水温（26±1）℃。数据采集和处理由Morris水迷宫图象自动监视处理系统完成。将各组的成绩进行比较。
        2.4  标本采集最后1次Morris水迷宫测试24 h后灌注取海马。大鼠用10%水合氯醛380 mg/kg腹腔注射，麻醉后立即开胸暴露心脏，经左心室插管至主动脉，同时剪开右心耳，快速灌注生理盐水，至肝脏变白改灌注液为4％多聚甲醛，灌注时间约30 min，见大鼠尾巴、四肢僵硬视为满意；灌注完毕后断头取脑，参照大鼠脑立体定位图谱分离海马，投入4％多聚甲醛溶液中过夜，石蜡包埋。
        2.5  Nestin检测取大鼠海马区石蜡标本，以4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2 min×3次。再加蒸馏水新鲜配置0.5％H2O2，室温30 min以灭活内源性过氧化氢酶。双氧水洗2 min×3次。滴加正常山羊血清，室温20 min。甩去多余液体，不洗。滴加一抗Nestin（1∶800），以PBS代替一抗作阴性对照，37℃下孵育1 h，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化二抗IgG（山羊抗兔）37℃30 min。PBS洗2 min×3次。滴加SABC，20～37℃20 min。PBS洗5 min×4次。DAB显色。蒸馏水反复洗涤。脱水，透明，封片。标本于显微镜下观察照相并计数。
        2.6  图像分析及统计学处理采用Nikon&Spot图像采集分析系统进行图像分析，在400倍高倍镜下每张切片随机选择10个视野观察。实验数据用SPSS13.0软件进行统计学处理。数据以±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)及q检验。
       3  结果
        3.1  各组水迷宫测验成绩的比较 见表1。
        与正常组及假手术组相比，模型组逃避潜伏期明显延长，撤离平台后大鼠在原平台象限内游泳时间占整个游泳时间的百分比显著降低，穿过原平台所在位置的次数明显减少，差异具有显著性；各治疗组与模型组相比，逃避潜伏期明显缩短，大鼠在原平台象限游泳时间占整个游泳时间的百分比显著升高，穿过原平台所在位置的次数明显增加，具有显著性差异。表1  各组水迷宫测验成绩的比较与模型组比较，*P<0.01；与正常组、假手术组比较，△P<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.05；与中剂量组比较，#P<0.01；n＝60  
        3.2  各组大鼠海马区Nestin阳性神经元数量染色阳性细胞数比较  见表2及图1～6。在正常组及假手术海马区，仅见零星分布的Nestin阳性细胞，细胞呈卵圆形、三角形或梭形，胞浆呈棕黄色，胞核为蓝色。在模型组，该区域可见到Nestin阳性细胞增多，与正常组及假手术组相比具有差异。低剂量组和中剂量组也有不同程度的增加，高剂量组Nestin阳性细胞数目最多，细胞密集，胞体肥大，伸出长短不一、粗细各异的突起。表2  各组大鼠海马区Nestin阳性神经元数量比较从以上各组大鼠海马区Nestin免疫组化染色图可见，模型组（图3）明显高于正常组（图1）、假手术组（图2），各治疗组明显高于模型组，高剂量组（图6）作用最强，中剂量组（图5）次之，低剂量组（图4）较弱。
       4  讨论
        4.1  药物作用   中医认为AD属于中医的“痴呆”或智能减退的范畴。中老年人由于肝肾不足，精气虚损，痰浊瘀血内生，以致风火痰瘀相互为患，痰瘀胶着不化，则气血精津难以上养于脑髓，发为痴呆。草苁蓉Boschniakia rossica Fedtsch.et. Flerov为列当科草本植物，俗称不老草，出自《吉林中草药》，主要分布于我国长白山区，系长白山珍奇植物之一，其地上部分据药物成分分析含草苁蓉醛和草苁蓉内酯等，根茎富含甘露醇和生物碱等。可全草入药，味甘咸、性温，具有滋补强身、益寿延年之功及补肾壮阳、润肠止血之效。
        实验研究表明，草苁蓉能使亚急性衰老大鼠脑组织的超氧化物歧化酶活性增强，抑制丙二醛活性并使之含量降低,且抑制单胺氧化酶活性［3］；草苁蓉还能使D-半乳糖所致大鼠衰老模型脑内的琥珀酸脱氢酶（SDH）活性增强,抑制乳酸脱氢酶（LDH）活性，说明草苁蓉能够改善细胞的能量代谢，使细胞处于功能活跃状态，且草苁蓉使神经元内的脂褐素(LPF)含量明显减少，由此说明草苁蓉对衰老大鼠脑组织有明显保护作用［4］。线粒体是细胞生物氧化的主要结构，当细胞受到内外因素干扰时，线粒体反应最早，变化也最明显。国外有人认为线粒体的改变与衰老关系密切［5］，有研究从脑形态学角度证实了草苁蓉能使衰老大鼠锥体细胞内线粒体肿胀程度减轻，保持核膜较规则［6］。因此，草苁蓉作为一种抗衰老的药物，具有广阔的开发前景。
        4.2  机理探讨   认知障碍及学习记忆下降是痴呆的临床特点之一。胆碱能纤维系统溃变则是痴呆的最重要的经典病理改变。痴呆患者的学习记忆障碍与脑内胆碱能系统密切相关，并且学习记忆障碍的程度与胆碱能纤维系统溃变的程度成正比，而基底前脑及海马是最重要的区域［7］。Morris水迷宫是检测动物记忆水平的重要工具。本实验的结果表明，各治疗组的逃避潜伏期较模型组明显缩短，大鼠在原平台象限游泳时间占整个游泳时间的百分比显著升高，穿过原平台所在位置的次数明显增加，提示草苁蓉能提高AD模型大鼠的学习记忆能力。
        许多原因所致的脑损伤早期即可诱导Nestin的表达，在损伤最重区域Nestin阳性细胞数目最显著，故Nestin可作为CNS损伤时最早、快速应答的敏感标志物；同时，Nestin是近年新发现的第Ⅵ类中间丝蛋白，被认为是神经干细胞的特异性标记物［8］，神经干细胞具有多分化潜能，可以分化成神经元和胶质细胞，并能自我更新，与神经再生密切相关。当发生脑缺血或其他脑损伤时，可诱导Nestin增殖、定向迁移及分化，对受损的脑组织结构进行修复和重塑［9］。Nestin的高表达可能预示了神经干细胞的激活，从而在脑损伤的修复中发挥重要作用。有人认为，Nestin的表达可能增加细胞的抗损伤能力，为判断CNS神经可塑性和损伤修复能力提供依据［10］。因此，在临床对于脑损伤的治疗中，有研究推测，凡能诱导巢蛋白表达增加的因素均可促进脑损伤后神经细胞的修复。实验显示，草苁蓉提取物各治疗组的Nestin的阳性表达总体上存在差异有显著性意义，说明草苁蓉可明显增强大鼠海马Nestin的免疫活性表达，诱导AD大鼠海马内的神经细胞增殖，参与了AD大鼠神经缺损的修复，并且改善了AD大鼠的认知能力，从而为中药草苁蓉临床防治AD提供了一定的实验依据。
       【参考文献】
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