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       【摘要】 
       目的探讨牡蛎酶解液的抗氧化活性。方法用普鲁士蓝反应法测定牡蛎酶解液还原能力，在DPPH体系、Fenton体系和邻苯三酚自氧化体系中分别检测牡蛎酶解液清除二苯代苦味酰自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（O2―·）的能力，并考察牡蛎酶解液在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化体系中的抗氧化作用。结果牡蛎酶解液清除DPPH·和·OH的EC50分别为7.313和1.330 mg/ml；牡蛎酶解液（17.800 mg/ml）对超氧自由基和卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率分别为19.86%和82.97%。结论牡蛎酶解液具有显著的清除DPPH·和·OH作用，且活性与剂量呈正相关，并对卵黄脂蛋白脂质过氧化也显示出了较强的抑制作用。
       【关键词】  牡蛎 酶解 自由基 抗氧化
       现代医学研究表明，适量的自由基在免疫反应、细胞分化、细胞凋亡和其它生化代谢过程中起着重要的作用，然而过量的自由基则在机体中引起一系列生物学反应，导致组织细胞、亚细胞和分子结构的破坏，并随着破坏层次逐渐扩展造成功能损伤，引起心血管疾病、癌症和衰老等，它是构成很多疾病的病理学基础。因此合理地使用抗氧化剂可以有效地预防和治疗某些疾病，延缓衰老。
        合成抗氧化剂往往具有一定的毒副作用，使得它们的使用受到严格控制。而天然抗氧化剂副作用较小，因此，寻找高效、价廉、低毒甚至无毒的天然抗氧化剂的工作备受人们关注。目前，抗氧化活性肽是天然抗氧化剂研究热点之一，而且现在大部分抗氧化活性肽是通过蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，比较符合现代人所追求的健康饮食的理念。
        牡蛎（oyster）俗称海蛎子、蚝等，是世界上第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一。牡蛎肉的主要营养成分为蛋白质和糖原，含量分别为50.63%和22.41%；其氨基酸组成完善，8种必需氨基酸含量占氨基酸总量的40%，而且还含有丰富的牛磺酸。此外，牡蛎肉中还含有多种矿物质和微量元素，其中锌和硒的含量丰富［1］。我国牡蛎资源丰富，且其蛋白质含量高，是采用酶解法制备生物活性肽的良好原料。本文就牡蛎酶解液的抗氧化活性进行全面地评估，为我国的牡蛎资源充分开发利用奠定基础。
       1  材料与仪器
        1.1  材料牡蛎（购于南宁海鲜批发交易市场）；胰蛋白酶（1：250，牛胰，Amresco分装）；二苯代苦味酰基(DPPH，1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，购自Sigma公司)；番红O（Safranin O，AMRESCO，上海生工生物工程有限公司）；2-硫代巴比妥酸（生化试剂，国药集团化学试剂有限公司）；铁氰化钾、硫脲、H2O2 、EDTA二钠盐、焦性没食子酸等均为国产分析纯。
        1.2  仪器LAMBDA BIO 20型紫外-可见分光光度计（美国PE公司）；DS-1高速组织匀浆机（上海标本模型厂）；TOMY RS-20Ⅱ型高速冷冻离心机（TOMY SEIKO CO.,LTD）；HH-W600型三用恒温水箱（江苏省金坛市医疗仪器厂）。
       2  方法
        2.1  牡蛎酶解液的制备［2］新鲜牡蛎去壳、洗净，得新鲜牡蛎肉，按料水比1∶3（mg∶ml）比例加入预冷的双蒸水，高速匀浆，加酶量为2％，在pH 8.0（用0.2N NaOH调节），45℃条件下，酶解6 h后，沸水浴灭活10 min，冷却，最后以7 000～8 000 r/min，4℃离心30 min，取上清液分装，即得牡蛎酶解液，冷藏备用。
        牡蛎酶解液的蛋白含量测定采用Folin-酚试剂法［3］。
        2.2  牡蛎酶解液还原能力的测定［4］采用普鲁士蓝反应法测定牡蛎酶解液的还原能力。其原理为：
        K3Fe (CN)6 + 样品 → K4Fe (CN)6 + 样品氧化物
        K4Fe (CN)6 + Fe3+ → K4［Fe (CN)6］3  (蓝色)
        在波长700 nm条件下测定吸光值A(A越大，则样品的还原能力越强)。
        取不同浓度的牡蛎酶解液稀释液（3.625，7.250，10.875，14.500，18.125 mg/ml）1.0 ml，再加入0.2 mol/L，pH6.6的磷酸盐缓冲液1.0 ml及1%的铁氰化钾〔K3 Fe（CN）6〕溶液1.0 ml，于50℃水浴反应20 min后急速冷却，再加入质量分数为10%的三氯乙酸(TCA)溶液1.0 ml，振荡均匀后，3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 ml，加入蒸馏水2.0 ml及质量分数为0.1%三氯化铁溶液0.5 ml，混合均匀，静置10 min后于700 nm测定其吸光值。
        2.3  牡蛎酶解液在DPPH体系中抗氧化性的测定［5］DPPH·(二苯代苦味酰基自由基)在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，呈紫色，在517 nm有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸收度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学计量关系的，因此可用与检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。
        取不同浓度的牡蛎酶解液稀释液（1.780，3.560，5.340，7.120，8.900 mg/ml）2 ml，加入1×10-4 mol/L DPPH无水乙醇溶液 2 ml，混匀后在室温下避光反应30 min，在517 nm下测定吸光度Ai，空白组以等体积无水乙醇溶液代替DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。
        清除率计算：清除率(%) = ［1－ (Ai－Aj)／A0］ ×100%
        式中：A0-对照组吸光度；Ai-样品组吸光度；Aj-空白组吸光度。
        2.4  牡蛎酶解液在Fenton体系中抗氧化性的测定［6］在Fenton反应体系中，·OH由EDTA-Na2-Fe(Ⅱ)-H2O2产生，由于·OH可特异性地使番红O（Safranin O）褪色,根据褪色程度用比色法来衡量·OH的含量。
        取0.15 mol/L，pH 7.4的磷酸缓冲液1.5 ml，110μg/ml的番红溶液0.2 ml，2 mmol/L的EDTA-Na2-Fe(Ⅱ) 0.7 ml，再分别加入不同浓度的样品溶液0.8 ml，最后加入体积分数为1.5%的H2O2 0.8ml以启动反应，混匀后于37℃水浴保温30  min，在波长520 nm处测吸光度A。空白组以等体积的去离子水代替样品溶液；对照组以等体积的去离子水代替样品溶液和EDTA-Na2-Fe(Ⅱ)溶液。清除率E (%)按下式计算,并以羟基自由基特异性清除剂—硫脲作阳性对照。
        E (%) = (A样品－A空白)/(A对照－A空白)×100%
        式中：A样品-样品组吸光度；A空白-空白组吸光度；A对照-对照组吸光度。
        2.5  牡蛎牡蛎酶解液在邻苯三酚体系中抗氧化性的测定［7～9］邻苯三酚在弱碱性（Tris-HCL缓冲溶液pH为8.20)环境中自身氧化分解产生O-2·和有色中间物(在320 nm处有最大吸收峰)，O-2·对自氧化又起催化作用，依据有色中间物生成量的多少，可判断O-2·生成量的多少。也由此出现的一系列颜色变化，可以利用分光光度法进行测定。当有抑制剂存在时，可清除氧自由基，从而阻止中间产物的积累，根据吸光度数值的变化可求出抗氧化剂的活性。
        取50 mmol/L ，pH 8.20 Tris-HCl缓冲液4.5 ml(其中含有2 mmol/L EDTANa2)，加入0.1 ml不同浓度的样液，于25℃保温10 min，然后加入25℃预温的4.5 mmol/L的邻苯三酚（用10 mmol/L HCl配制）0.2 ml，混匀后迅速于干燥的比色皿中，在320 nm下每隔半分钟测定一次OD值，以等体10 mmol/L HCl代替邻苯三酚溶液为空白调零，对照组以等体积去离子水代替样品。作吸光度随时间变化曲线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按下式计算样品对O-2·的抑制率。
        抑制率 (%) = ( V对照－ V样品)/ V对照×100%
        式中：V对照-对照组邻苯三酚自氧化速率(△OD/min)；V样品-样品组邻苯三酚自氧化速率(△OD/min)。
        2.6  牡蛎酶解液在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化体系中抗氧化活性(AOA)的测定［10，11］卵黄中磷脂C-2位上所含极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）过不饱和脂肪酸（PUFA）在铁离子的催化下，经振荡，能诱发过氧化，产生烷氧基（LO·）和烷过氧基（LOO·）物质，再引发链式反应。在加热的条件下，过氧化产物可与硫代巴比妥酸（TBA）反应产生红色化合物，并在波长为532 nm处有强吸光度。当有抗氧化剂存在时，可清除过氧化产物，从而阻断链式反应的发生，使得该卵黄脂蛋白脂质过氧化体系的过氧化产物生成受阻，根据吸光度数值的变化可求出抗氧化剂的活性。
        选用1∶25的卵黄悬液（卵黄用等体积的0.1 mol/L，pH 7.45的磷酸缓冲液PB配成1∶1悬液，磁力搅拌10 min，再用PB稀释成1∶25的悬液置于冰箱中备用）并吸取0.2 ml，加入不同浓度的牡蛎酶解液稀释液0.1 ml，加入25 mmol/L FeCl2 0.2 ml，用0.1 mol/L，pH 7.45的PB补充至2 ml，37℃培养12 h ，取出后加入0.5 ml 20%的三氯醋酸（TCA），静置10 min，以3500 r/min离心10 min，取2.0 ml上清液加入0.8%TBA（2-硫代巴比妥酸）1.0 ml，加塞，放入沸水浴中15 min，冷却后，于532 nm处比色测定吸光值（A），对照管除不加样品液外，其它试剂同前，所测吸光值为A0，空白管调零，空白管以2.0 ml PB代替，样品对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率用AOA表示：AOA（%）=(A0－A) / A0×100%。
       3  结果
        3.1  牡蛎酶解液还原能力依据“2.2”还原能力的测定方法，在700 nm处的吸光度越大，样品的还原能力越强。由表1和图1可知，牡蛎酶解液在其浓度范围内随着浓度的增加而增大；与阳性对照—硫脲相比，其还原能力较弱。
        而一般情况下，样品的还原能力与抗氧化能力呈正相关，所以牡蛎酶解液的抗氧化能力随其浓度的增加而增强。表1  牡蛎酶解液的还原能力
        3.2  牡蛎酶解液在DPPH体系中抗氧化性依据“2.3” DPPH体系测定方法，(Ai－Aj)为样品组中单电子未被配对的DPPH·的吸光度值，该值越小，样品清除DPPH·的能力越强。由表2可知，牡蛎酶解液清除DPPH·的能力随浓度增大而增强。
        牡蛎酶解液清除DPPH自由基的能力以EC50来衡量，EC50的定义为：使得DPPH自由基的清除率达到50％时需要的样品液的浓度，通过回归方程可求出EC50。依据回归方程Y= 6.42X + 3.048 7，r=0.993 7求得牡蛎酶解液清除DPPH·的EC50为7.313 mg/ml。表2  牡蛎酶解液对DPPH·的清除作用（
        3.3  牡蛎酶解液在Fenton体系中抗氧化性依据Fenton体系反应原理，样品组在520 nm处测定的吸光度值越大，其清除·OH的能力越强，其在该体系中抗氧化能力越强。由表3可知，牡蛎酶解液和硫脲清除·OH的能力随它们的浓度增大而增强。
        牡蛎酶解液和硫脲对·OH的清除作用的回归方程分别为Y = 29.261X + 11.078 ，r=0.975 0和Y = 7.826 9X + 13.725，r=0.990 2。 求得牡蛎酶解液和硫脲清除·OH的EC50分别为1.330 mg/ml和4.635 mg/ml，表明牡蛎酶解液对·OH有较强的清除作用，而且其清除·OH能力强于阳性对照药物硫脲。表3  牡蛎酶解液和硫脲对·OH的清除作用
        3.4  牡蛎酶解液在邻苯三酚体系中抗氧化性依据“2.5”邻苯三酚自氧化体系的测定方法,在波长320 nm处测定的吸光度越小,样品的抗氧化能力越强。由图2可知,超氧阴离子自由基的产生和邻苯三酚产生有色物质的变化随着时间的变化而保持相对的稳定。不同浓度的牡蛎酶解液对邻苯三酚的自氧化均有一定的抑制作用，且随着牡蛎酶解液浓度的增加而增大，其抑制率分别为4.29 %，9.66%，13.95%，17.35%，19.86%。由此可知牡蛎酶解液在邻苯三酚体系中抗氧化性能力较弱，当样品为牡蛎酶解液母液时，抑制率仅达19.86%。
        图2  牡蛎酶解液对超氧阴离子（O-2·）的抑制作用
        3.5  牡蛎酶解液在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化体系中抗氧化活性由表4及图3可知牡蛎酶解液对PUFA过氧化体系的抑制作用随样品浓度的增大,抗氧化活性也明显增加。当样品为牡蛎酶解液母液时，抑制率AOA（%）值达到（82.97±0.25）%。
        表4  牡蛎酶解液对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用(±s)
        浓度C/mg·ml-1OD532抑制率（%）7.1201.159±0.00210.55±0.5510.6801.030±0.01820.53±0.7714.2400.647±0.00950.09±1.0817.8000.221±0.00282.97±0.25对照1.296±0.010 
       4   结论
        牡蛎酶解液显示出了一定的还原能力，证明其具有一定的抗氧化活性。
        牡蛎酶解液清除·OH的效果强于硫脲，其清除·OH的能力是硫脲的3.5倍；牡蛎酶解液在DPPH体系中也具有较强的清除DPPH自由基的能力。
        图3  牡蛎酶解液对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用
        在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化体系中有明显的抑制作用。
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