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       【摘要】 
       目的探讨由黄连、黄芪和地黄水提物组成的组合物(简称三黄组合物，SH)对2型糖尿病(DM)大鼠糖脂代谢的影响并初探其机制。方法以高糖高脂饲料喂养SD大鼠两个月后小剂量腹腔注射链脲佐菌素（STZ）(25 mg·kg-1)，连续注射3 d，建立糖尿病大鼠模型，随机分为模型组(MC)，盐酸二甲双胍组(Met)，三黄组合物低剂量组(SHL)、中剂量组(SHM)、高剂量组(SHH)，外加常规饲料喂养的正常组。给药后第3，10周测空腹血糖水平(FPG)，第7周测糖异生水平。于实验结束时腹主动脉取血，测血清胰岛素(Insulin)，总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，谷丙转氨酶(ALT)，尿酸(Uric acid)，游离脂肪酸(FFA)含量，取肝脏测肝糖原含量。结果与模型组相比，SH各剂量组都能显著降低糖尿病大鼠的血糖水平，以中剂量组效果最明显，与二甲双胍组相近；三黄组合物可以降低DM大鼠TC，TG，LDL-C含量，升高HDL-C水平，促进胰岛素分泌和肝糖原的合成，抑制糖异生，调节血清FFA，ALT的含量。结论三黄组合物可以有效降低糖尿病大鼠的血糖水平，调节血脂异常，其机理可能包括保护和修复胰岛，促进胰岛素分泌，抑制糖异生，促进肝糖原合成等，此外，三黄组合物对大鼠肝脏也有一定的保护作用，对抑制尿酸沉积，提高尿酸清除率，从而改善胰岛素抵抗，保护肾脏，防治DM并发症具有积极作用。
       【关键词】  糖尿病 高血脂 黄连 黄芪 地黄 组合物
       随着对天然中草药研究的不断深入，越来越多的中草药已被发现并证实具有降血糖作用。我们在深入考察大量古方并结合现代药学科研文献的基础上，优化组合了以黄连、黄芪和地黄3味中药组成的降糖药物组合物（简称三黄组合物，SH)，通过发挥各味药在降低血糖及改善并发症方面的协同作用，以期达到更佳的降血糖疗效。本实验即对本组合物进行了主要的药效学研究，并在此基础上进行了初步的机理探讨。
       1  材料与仪器
        1.1  动物SD大鼠，雄性，180～220 g，洁净级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证: SCXK(京) 2006-0008。实验室温度20～25℃，湿度50%～60%，12 h交替光照，动物购进后自由饮食饮水。
        1.2   器材强生One Touch Ultra血糖仪，强生(中国)医疗器材有限公司；高速冷冻离心机，美国Thermo公司产品；MD-200半自动生化分析仪，华士信医疗集团公司产品；TU-1810紫外可见分析仪，北京普析通用仪器有限责任公司产品。
        1.3   药品与试剂黄连、黄芪、地黄的药用饮片，购自北京京卫大药房, 经同仁堂范国强教授鉴定分别为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch的干燥根茎，豆科植物蒙古黄芪Astragalus membrana -ceus (Fisch.) Bge.ver.mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根，玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch的干燥根茎，用时以黄连、黄芪、地黄按生药量1∶4∶2的比例提取得水煎剂，混合浓缩至相应浓度，4℃保存备用；盐酸二甲双胍，贵州天安药业股份有限公司产品；链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司生产；柠檬酸、柠檬酸三钠，北京化工厂，A.R产品；强生稳豪血糖试纸，LifeScan公司产品；总胆固醇试剂盒，甘油三酯试剂盒，高、低密度脂蛋白试剂盒，葡萄糖测定试剂盒，均购自中生北控生物科技有限公司产品；游离脂肪酸，尿酸，转氨酶，胰岛素测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所产品。
       2  方法
        2.1   糖尿病大鼠模型的建立参照文献［1，2］设计，略有改进。取SD雄性大鼠70只，按体重随机分为6组，一组为正常对照组(NC)，常规饲料喂养，其余五组喂高糖高脂饲料，诱导胰岛素抵抗(高糖高脂饲料配方：10%猪油、20%蔗糖、1%胆酸钠、2.5%胆固醇、66.5%常规饲料，北京科澳协力饲料有限公司制作)。8周后，将高糖高脂饲料喂养的大鼠禁食12 h，ip新鲜配制的STZ溶液(25 mg·kg-1)，连续注射3 d，空白对照组ip柠檬酸－柠檬酸三钠缓冲溶液，72 h后，将大鼠禁食3 h，剪尾测空腹血糖值，取连续3 d测得的血糖值大于11.1 mmol·L-1者为造模成功者。
        2.2   分组与给药将造模成功大鼠共57只，按血糖值随机分为5组，其中，模型对照组(MC)10只，阳性药盐酸二甲双胍对照组（Met 0.3 g·kg-1）11只，三黄组合物低剂量组（黄连0.5 g·kg-1，地黄1 g·kg-1，黄芪2 g·kg-1，SHL)、中剂量组(黄连 1 g·kg-1，地黄 2 g·kg-1，黄芪 4 g·kg-1,SHM)、高剂量组(黄连2 g·kg-1，地黄4 g·kg-1，黄芪8 g·kg-1,SHH)各12只，灌胃给药。其中，正常组与模型组给予相应剂量的自来水。除NC外，其他组继续高糖高脂饲料喂养。
        2.3   空腹血糖(FPG)与血脂水平的测定灌胃治疗第3、10周大鼠禁食3 h，剪尾取血测定大鼠FPG。于实验结束前1天，大鼠禁食14 h，ip戊巴比妥钠麻醉大鼠，经腹主动脉取血，半自动生化分析仪测定大鼠血清TC，TG，HDL-C，LDL-C水平。
        2.4   血清胰岛素(insulin)，血清转氨酶量(ALT)，游离脂肪酸(FFA)，尿酸(uric acid)的测定    按照试剂盒说明书测定，所用仪器为半自动生化分析仪。
        2.5   肝糖原提取和含量测定实验末期处死大鼠，取肝脏，将表面血液冲洗干净，称取0.1 g左右，用PBS组织匀浆(1 g∶50ml)，加4％的磺基水杨酸0.5 ml于0.5 ml匀浆中，混匀，离心，取上清液沸水浴15 min，冷却，冰浴下加蒽酮试剂，TU-1810紫外可见分光光度计测620 nmOD值。
        2.6   糖异生实验大鼠灌胃治疗7周后，禁食12 h，ip L-丙氨酸（2 g·kg-1），采集0，60 min时血测血糖水平。
        2.7   数据处理实验数据以±s表示，采用双样本等方差分析的t检验进行统计分析。
       3  结果
        3.1   三黄组合物对糖尿病大鼠FPG的影响如表1所示，给药后第3周，除低剂量组作用不明显外，阳性药组，中、高剂量组血糖与模型组比较均显著降低(P<0.05，P<0.01)，第10周测大鼠血糖水平，结果显示各给药组DM大鼠血糖降低很明显，与模型组比较差异较显著(P<0.001)，其中，三黄中剂量组与阳性药比较无统计学差异。表1  三黄组合物对糖尿病大鼠血糖的影响与模型组比较：1）P<0.05, 2）P<0.01, 3）P<0.001；n=10
        3.2   三黄组合物对DM大鼠血脂水平的影响    如表2所示，高糖高脂饲料喂养并灌胃给药10周以后，模型组TC，TG水平明显高于其他给药组，而不同剂量组之间以及三黄组与阳性药组之间比较无统计学差异。对于HDL-C， LDL-C，与模型组比较，组合物中、高剂量组效果最明显(P<0.05)，而阳性药组在升高HDL-C方面与模型组比较无统计学意义。表2  三黄组合物对DM大鼠血脂水平的影响与模型组比较，1）P<0.05,2）P<0.001；n=10
        3.3   三黄组合物对DM大鼠Insulin，FFA，Uric acid和ALT的影响    胰岛分泌胰岛素是调节血糖水平的重要环节，在DM大鼠灌胃治疗10周后，测血清胰岛素水平，如表3所示。与模型组比较，三黄中剂量组升高胰岛素含量水平明显(P<0.05)，而其他剂量组及阳性药组与模型组比较无统计学差异。同时，尿酸水平测定结果显示，与模型组相比，DM大鼠各给药组尿酸含量都有降低，以高剂量和阳性药最明显(P<0.01或P<0.001)。由表3可见，比较血清中谷丙转氨酶含量，给药组与模型组比较差异显著(P<0.05或P<0.001)。此外，于实验末期测血清游离脂肪酸，结果可见，与模型组比较，三黄各剂量组都能明显降低FFA的水平，其中高剂量组效果优于阳性药组。表3  三黄组合物对DM大鼠胰岛素、游离脂肪酸、尿酸和血清转氨酶的影响 与模型组比较，1）P<0.05, 2）P<0.01, 3）P<0.001；n=10
        3.4   三黄组合物对DM大鼠糖异生和肝糖原合成的影响 如表4所示，三黄中剂量组抑制糖异生作用。与模型组比较，P<0.05，作用明显，阳性药组和高、低剂量组也有降低，但与模型组比较无统计学意义。此外，给药10周后测大鼠肝糖原含量。结果表明，给药组能有效的促进糖原合成，与模型组比较，各组均有显著差异。表4  三黄组合物对DM大鼠糖异生和肝糖原的影响与模型组比较，1）P<0.05, 2）P<0.01, 3）P<0.001；n=10
       4   讨论
        黄连是我国传统中药中的一味古老药物，含有多种生物碱，研究表明其中主要成分小檗碱和药根碱，能降低正常小鼠及四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖［3］。地黄水提液能耐降低糖尿病大鼠血糖，增加胰岛素敏感性，改善脂代谢紊乱及胰岛素抵抗［4］。黄芪多糖具有双向调节血糖的作用，对糖尿病大鼠肾脏有较好的保护作用［5，6］。
        本实验结果说明，通过长期高糖高脂饲料喂养，加以小剂量多次注射STZ的方法可以成功诱导2型糖尿病，并伴随TC,TG，LDL-C的升高和HDL-C的降低。三黄组合物能有效降低2型糖尿病大鼠模型的血糖水平，其降血糖作用与阳性药相比，虽然具有统计学差异但并不具备明显的生物学差异。从治疗后的血糖水平看，中剂量组与阳性药组最接近，效果最明显。同时，三黄组合物也可以降低血清总胆固醇和甘油三酯水平，升高HDL-C，回调LDL-C，从而有效调节糖尿病状态下的血脂异常。此外，实验末测定大鼠的ALT和尿酸，可见三黄各给药组都能不同程度地抑制ALT和尿酸的生成，而且以高剂量组效果最明显。ALT主要存在于肝细胞浆内，是肝功能损坏最敏感的检测指标，而尿酸是细胞新陈代谢的产物，肾脏出现病变后对尿酸的清除进行性下降，导致血尿酸水平升高，长期高尿酸水平是胰岛素抵抗综合症的特征表现之一［7］。本实验结果表明，三黄组合物在降低血糖同时，对大鼠肝脏也具有一定保护作用，对抑制尿酸沉积，提高尿酸清除率，从而改善糖尿病胰岛素抵抗状态，保护肾脏，防治痛风的发生具有积极作用。
        在进行药效学研究的基础上，我们对三黄组合物的降血糖机制作了初步探讨，如其是否促进肝糖原合成、抑制糖异生、调节胰岛素分泌及促进FFA代谢等。结果表明，三黄组合物各剂量组都能有效促进糖原合成，其中以中剂量效果最佳，优于双胍组。 此外，各给药组都显示出一定抑制糖异生和促进胰岛素分泌的趋势，虽然除中剂量组外，其他剂量给药组与模型组比较没有统计学意义，但分析趋势我们仍然可以得出三黄组合物降糖机理应该包括抑制糖异生和促进胰岛素分泌从而降低血糖的作用。同时，三黄组合物还可以有效促进FFA的代谢。越来越多的研究发现FFA长期升高会对胰岛β细胞产生毒性，促进β细胞的凋亡［8］，而三黄组合物可以拮抗这种作用。可见，三黄组合物降血糖机制应该也包括通过促进FFA代谢，间接保护胰岛细胞从而实现促进胰岛素分泌的作用。
        综合以上实验结果可以看出，三黄组合物可以有效治疗糖尿病及相关疾病，效果与二甲双胍基本相似，但在预防并发症方面优于二甲双胍。同时，我们观察到，三黄组合物降血糖效果基本符合剂量-效应关系，但剂量太高，效果增大并不明显，可能由于高剂量药物浓度过高导致药物代谢不够完全而影响了药效发挥。此外，关于三黄组合物的降糖机制还需要进行深入实验研究，我们将从分子水平如Glut-4、PPAR受体以及酶水平进行进一步探讨。
       【参考文献】
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