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       【摘要】 
       目的观察抗纤灵对5/6肾切除大鼠肾组织核因子κB（NF－κB）及肿瘤坏死因子α（TNF－α）、白细胞介素6（IL－6）mRNA表达的影响。方法采用5/6肾切除法建立慢性肾衰大鼠模型，4周后按血肌酐水平将造模大鼠分为模型组和抗纤灵低、中、高剂量治疗组， 8周后免疫组化法测定肾组织NF－κB 表达；RT－PCR法测肾组织TNF－α，IL－6mRNA表达。结果模型组大鼠肾组织NF－κB 及TNF－α，IL－6mRNA表达均较正常组明显升高（P<0.01）；3个剂量治疗组与模型组比较均明显下降（P<0.01）。结论抗纤灵可通过降低模型大鼠肾组织NF－κB及TNF－α，IL－6mRNA表达延缓肾纤维化进展。
       【关键词】  抗纤灵 肾纤维化 核因子κB 肿瘤坏死因子α 白细胞介素6
       肾纤维化包括肾小球硬化和肾间质纤维化，是导致慢性肾功能衰竭的主要途径。研究证实有多种因素参与了肾纤维化的发生发展，核转录因子κB（NF-κB）作为一种多向性调节因子，在肾纤维化进展中起重要作用，肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）作为重要的促炎症因子也参与其中，但目前研究多集中在此三者在肾间质纤维化中的作用。本实验采用了经典的肾小球硬化大鼠模型，观察抗纤灵对其的影响。
       1  器材与方法
        1.1  模型建立  清洁级雄性Wistar大鼠62只，体重（180±20）g，上海中医药大学实验动物中心提供, 2％戊巴比妥钠按40 mg／kg剂量腹腔注射麻醉。大鼠俯卧暴露左肾区。备皮后，从距左脊肋骨1.5 cm处作斜向外方切口，经后腹膜取肾，暴露肾脏，剥离肾周脂肪及包膜后，弧型切除肾组织(主要切除皮质部分)约0.6 g。消毒棉球压迫止血，切面无活动性出血后复位剩余左肾并缝合。10 d后相同方法麻醉大鼠，完全游离右侧肾蒂后结扎，行右肾全摘除。两次手术共切除肾脏约80％。
        1.2  分组方法  大鼠进入实验室适应性饲养1周后，随机取8只为正常组，其余为造模组，将造模组大鼠按上述标准Platt法制作慢性肾衰动物模型，术后4周尾静脉采血，自动生化分析仪测定肾功能，按血肌酐水平随机分为模型组和抗纤灵低、中、高剂量治疗组。
        1.3  药物组成与给药方法
        1.3.1  药物组成与制备  抗纤灵组成为丹参30 g，制大黄15 g，桃仁15 g，全当归15 g，牛膝15 g，由上海中医药大学附属曙光医院制剂室制成每毫升含生药1.5 g的水提剂。
        1.3.2  给药方法与周期  治疗组予抗纤灵水提剂灌胃，低、中、高剂量治疗组用药量按临床成人每千克体重用量的5，10，15倍换算，分别为0.75 g（0.5 ml）/100 g大鼠、1.5 g(1ml)/100 g大鼠和2.25 g(1.5ml)/100 g大鼠，连续8周。各组大鼠每天分2次灌胃。
        1.4  取材 治疗结束后各组大鼠首先分别置代谢笼内留取24 h尿液，末次给药后禁食l2h，摘眼球采血后，迅速脱颈椎处死动物，取出残肾，冰上操作留取肾皮质，快速置于液氮中。
        1.5  检测指标与检测方法
        1.5.1  肾组织NF-κb采用免疫组化法（SABC），NF-κB/P50(R)1∶200购自美国Santa Cruz公司，组织标本经10％甲醛固定，PBS液洗4 h，系列乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片厚度4 μm，常规脱蜡、修复，适当稀释一抗，4℃过夜，0.3％过氧化氢抑制内源性过氧化物酶，加生物素化二抗，DAB显色，苏木素衬染，树脂封片。结果采用复旦大学医学图象检测中心IMS细胞图像分析系统进行分析，每张标本随机选取3个视野，计算每个视野内染色区域的阳性反应面积和阳性反应强度，取每组均值进行比较。
        1.5.2  肾组织TNF－α，IL－6 mRNA表达RT－PCR法检测
        仪器：4℃,-20℃和-70℃冰箱；JB50-D型匀浆器（含玻璃匀浆管及杵）；1.4万转台式冷冻离心机；真空离心干燥器；真空泵；PCR基因扩增仪（PE公司 9600型）；计算机图象分析系统（上海复日科技有限公司FR-2000型）。
        试剂：DEPC（博彩生物技术公司），Trizol，200U/μl M-MuLV，5U/μlTaq  polymerase(Gibco)，40U/μl RNAsin(promaga)，10mM dNTP（博彩生物技术公司），DNA marker (each 100bp, 生工生物技术公司)   。
        引物合成：根据已发表的基因库及参考文献设计，上海博彩生物技术有限公司合成，内参β-actin引物：上游：5"- TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG -3"；下游：3"- CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATGGAGG - 5"，长度285 bp；TNF-a引物：上游：5"-CTCATTCCCGCTCGTGG-3"，下游：3"-CGTTTGGTGGTTCGTCTCC- 5"，长度200 bp；IL-6引物：上游：5"-ccggagaggagacttcacag -3"，下游：3"-gagcattggaagttggggta -5"，长度428 bp。
        RNA抽提（GIBCOBRC公司Trizol试剂盒）：组织50 mg加Trizol液1 ml匀浆，取匀浆液1 ml加氯仿0.2 ml颠倒15 s，22℃静置3 min，4℃15 000 r/min离心15 min后取上清液0.5 ml加0.5 ml异丙醇混匀，22℃静置10min，4℃ 15 000 r/min再次离心10 min，弃上液加入1 ml 4℃ 75%乙醇离心，弃上液后真空干燥5 min，25 μl DEPC处理水溶解，-70℃保存。
        逆转录：取dNTP（10 mmol/L 1 μl）、随机引物（100 μmol/L 1 μl）、组织总RNA 2 μg ,加水至12 μl，65℃ 5 min，快速插入冰水，冰上加入buffer 4 μl,DTT（100 mM）2 μl,RNAsin（40 U/ul）1 μl ，25℃ 10 min后加M-MLV反转录酶（200 U/μl）1 μl，37℃ 50 min，70℃ 15 min。
        PCR扩增：取dNTP（each 10 mmol/L）1 μl,10×buffer 4μl,上游引物（5 μmol/L）2 μl,下游引物（5 μmol/L）2 μl,反转录产物2 μl,TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.4 μl，加水至40 μl，PCR反应条件为94℃3 min，94℃40 s，55℃1 min，72℃1 min共30个循环；72℃5 min4℃保存。
        电泳：取PCR产物20 μl与上样缓冲液5 μl混匀后，上样于1.6%的琼脂糖凝胶中，其中一孔加DNA marker，80V电压电泳1 h，凝胶分析系统观察拍照、分析。
        数据处理：用FR-2000型图象分析系统进行光密度扫描，以目的基因光密度值与对应样品内参基因光密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量。最后以目的基因的相对转录量为参数进行统计分析。图象分析的方法是：在同一块凝胶内选取任一条带（通常选mark中的一条条带）作为参照条带，设定其浓度为一数值（如为20），然后再选取目的条带，计算机系统会以参照条带为基准，自动测算其浓度。
        1.6  统计学处理  所有数据均用±s表示，应用SPSS11.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。
       2  结果
        2.1  抗纤灵水提剂对CRF大鼠肾组织NF－κB的影响模型组大鼠肾组织NF－κB表达较正常组比较明显升高，3个治疗组与模型组比较均明显降低。结果见表1。
        表1  抗纤灵水提剂对CRF大鼠肾组织NF－κB的影响（±s）
        组别n阳性表达强度阳性反映面积A/μm2正常84.44±0.537 271.00±1 377.27模型98.56±1.24*23 033.00±6 028.65*抗纤灵低剂量77.56±1.51＃20 659.44±4 282.02抗纤灵中剂量125.44±0.53＃＃17 965.67±4 886.07＃抗纤灵高剂量117.22±1.09＃＃17 819.00±4 818.89＃
        与正常组比较，* P<0.01；与模型组比较，＃P<0.05，＃＃P<0.01
        2.2  抗纤灵水提剂对CRF大鼠肾组织TNF－α，IL -6 mRNA表达的影响模型组大鼠肾组织TNF－α，IL -6mRNA表达较正常组比较均明显升高（P<0.01），3个治疗组与模型组比较均明显降低（P<0.01），抗纤灵中、高剂量组IL -6mRNA表达与抗纤灵低剂量组比较也有显著差异。结果见表2。
        表2  抗纤灵水提剂对CRF大鼠肾组织
        TNF－α，IL－6mRNA表达的影响（±s）
        组别nTNF－αIL-6mRNA正常81.65±0.250.44±0.07模型93.61±0.24*0.77±0.03*抗纤灵低剂量72.30±0.17＃0.58±0.05＃抗纤灵中剂量122.04±0.89＃0.47±0.01＃☆抗纤灵高剂量112.16±0.1＃0.46±0.05＃☆
        与正常组比较，* P<0.01；与模型组比较，＃P<0.01，与抗纤灵低剂量组比较，☆P<0.05
       3  讨论
        抗纤灵为本实验组有长期研究基础的治疗慢性肾功能衰竭的有效成方，以往研究已证实该方可通过多种途径延缓慢性肾衰肾纤维化进展［1～3］。本次实验在以往研究基础上，着重从炎症介质方面探讨抗纤灵的药效学机理。
        NF-κB是转录因子家族的重要成员，参与多种炎症性细胞因子、趋化因子和促纤维化因子的合成，能与多种细胞因子、生长因子、化学趋化因子以及细胞外基质基因的启动子上的特异位点结合，启动其转录，在免疫炎症反应、抗凋亡和肿瘤发生中起着重要作用。在细胞正常状态下，NF-κB 与其抑制因子IκB 结合成复合体存在于胞质中，不具有活性，当细胞受到各种外界刺激时，IκB迅速发生蛋白酶解，NF-κB 活化并转移至胞核内，与靶基因启动子区域的κB基因结合，从而启动基因转录和蛋白合成。由于大多数肾脏疾病都涉及到细胞增殖和免疫炎症反应，存在各种细胞因子的异常表达，而NF-κB可参与许多细胞因子的表达调控，所以NF-κB在肾脏病的发病和进展机制中扮演重要角色。各种肾脏病所致的高肾素-血管紧张素活性［4］、蛋白尿［5］或白蛋白尿［6］都可以引起肾脏固有细胞的NF－κB异常活化，促进一系列细胞因子及细胞外基质的转录和表达。本研究以免疫组化法检测了慢性肾衰大鼠肾组织NF-κB表达，结果表明，模型组大鼠肾组织NF-κB阳性表达强度和阳性反应面积均明显高于正常组，提示模型组大鼠肾组织NF-κB激活明显，低、中、高剂量治疗组阳性表达强度和阳性反应面积与模型组比较均明显降低，提示抗纤灵可抑制肾组织NF-κB活性，降低NF-κB高表达。
        NF-κB可调控众多炎症因子(包括IL-2、IL-8、IL-10、TNF等)的表达。在炎症反应中起着中心环节的作用。在所有与肾纤维化有关的炎症因子中，IL-6和TNF－α是最为重要，也是与NF-κB关系最为密切的两种炎症因子。IL-6是一种具有多种生物活性的细胞因子，可由系膜细胞合成分泌，在免疫及炎症中起重要的调节作用。临床上许多自身免疫性疾病包括肾小球疾病时IL-6均增高，肾脏的固有细胞特别是系膜细胞均能分泌IL-6，IL-6又刺激系膜细胞增殖，促进肾小球损害进展，所以IL-6在肾脏局部以自分泌、旁分泌的方式刺激系膜细胞增殖是促进肾小球损害的因素之一。近年研究发现CRF患者尿IL-6的含量显著高于健康人，用大黄治疗后尿IL-6含量及血肌酐水平显著下降［7］。TNF分为两种类型，TNF-α和TNF-β，前者与肾脏疾病关系非常密切，TNF-α作为一种重要的炎症介质，可通过与其受体结合促进NF-кB的活化，从而引起一系列瀑布式反应，进而刺激成纤维细胞和系膜细胞的活化和增殖，导致肾纤维化发生；亦可通过刺激肾小管细胞分泌促纤维化因子，促使细胞外基质沉积加重纤维化，或刺激肾小管细胞分泌趋化因子和粘附因子，导致间质炎性细胞浸润导致纤维化的发生［8］。同时TNF－α还会与其它细胞因子，尤其是IL-1，IL-6等产生诱生和协同作用，共同促进肾脏纤维化的发生和进展。本组实验采用RT－PCR法检测各组大鼠肾组织内IL－6mRNA和TNF－αmRNA表达，结果表明，模型组大鼠IL－6mRNA和TNF－αmRNA比正常组明显升高，抗纤灵低、中、高剂量治疗组可明显降低模型组大鼠IL－6mRNA和TNF－αmRNA高表达，提示抗纤灵改善慢性肾衰模型大鼠肾功能与降低其肾组织IL－6和TNF－αmRNA高表达有关。
       【参考文献】
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