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       【摘要】 
       目的研究川楝子致小鼠肝毒性的时效、量效关系。方法小鼠灌服不同剂量川楝子，测定其LD50。另取小鼠按不同时间点或不同剂量分组，检查血清ALT，AST，计算肝、脾、胸腺脏器指数，并观察肝组织形态变化。结果小鼠灌服川楝子的LD50为200 g·kg-1。ALT，AST在给药后1 h达到高峰，24 h可恢复近正常值。与正常组比较，川楝子81，166 g/kg剂量组对肝组织产生明显损伤，且随着剂量增大，ALT，AST升高显著(P<0.05或P<0.01)。结论小鼠单次灌服一定剂量川楝子可造成急性肝损伤甚至死亡，并显示有毒性时效、量效关系。
       【关键词】  川楝子 小鼠 肝毒性
       川楝子Fructus Toosendan为临床常用药。《中国药典》2005年版所载川楝子为楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc.的干燥成熟果实，性味苦寒，有小毒，归肝、小肠、膀胱经，具有疏肝泄热、行气止痛、杀虫等功效，临床用于治疗胸胁、脘腹胀痛、疝气痛、虫积腹痛。有关川楝子毒性的记载首见于《名医别录》。为进一步明确川楝子的肝毒性特点，本实验就小鼠单次灌服川楝子后肝毒性的时效与量效关系进行了初步研究。
       1  材料与仪器
        1.1  动物KM小鼠，清洁级，18～20 g，雌雄各半，上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号SCXK(沪)2003－0003。饲养于上海中医药大学实验动物中心。
        1.2  药物川楝子原药材购于上海养和堂张江分店，四川产，批号051216，经上海中医药大学中药学院赵志礼教授鉴定系为楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc.的干燥成熟果实。
        川楝子药液的制备（水提醇沉）：将药物粉碎呈颗粒状，水煎3次。合并3次药液，过滤，浓缩，加乙醇，回收乙醇。将上述水提醇沉液浓缩至浓度为10 g/ml，置冰箱，保存备用。临用前，用蒸馏水分别配成所需浓度的药液（以下简称“川楝子”）。
        1.3  试剂丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂（批号060339）；天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂（批号051210，均由上海丰汇医学科技有限公司提供）。
        1.4  仪器AR2130电子天平（奥豪斯国际贸易上海有限公司）；全自动生化分析仪HITACHI7020（日本HITACHI公司）；系统显微镜BX51/BX52（日本奥林巴斯光学株式会社）；全能型脱水机（徕卡公司）。
       2  方法
        2.1  口服半数致死量(LD50)测定取小鼠，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。在168～232 g/kg之间按照等比级数(0.9)确定4个给药剂量。各给药组按0.4 ml/10 g灌胃1次，正常组同时灌服等容量蒸馏水。连续观察7 d。观察并记录给药后的一般状况和死亡情况；死亡小鼠解剖后肉眼观察各脏器有无异常变化。
        2.2  口服“毒性时效”关系研究取小鼠，雌雄各半，随机分为8组，按处理时间点依次为0（即正常组），1，2，6，12，24，48，72 h组。按0.4 ml/10 g灌胃1次，0 h组小鼠灌服蒸馏水，其余各组灌服188 g/kg川楝子。于相应时间点称量小鼠体重，摘眼球取血，血3 000 r/min离心10 min，取血清，以全自动生化分析仪测定血清ALT，AST。摘取小鼠肝脏、脾脏、胸腺，称重并计算脏器指数［4］。另取一部分肝组织，常规HE染色，光学显微镜下观察其组织形态学变化。对肝组织形态进行病理分级、积分［1］：肝组织结构正常，无明显变性、坏死及炎症细胞浸润，0分；肝小叶结构尚正常，可见明显的混浊肿胀、气球样变或脂肪变性，散在点状坏死(＋)，1分；肝小叶结构不清，可见明显的灶状坏死，伴有炎症细胞浸润(＋＋)，2分；肝小叶结构不清、可见明显的片状坏死，伴有炎症细胞浸润(+++)，3分；坏死细胞弥漫性存在于肝小叶中央，层次较多，伴有炎症细胞浸润(++++)，4分。
        2.3  口服“毒性量效”关系研究取小鼠，雌雄各半，随机分为6组，即正常组和川楝子5个剂量组。按0.4 ml/10 g灌胃1次，正常组灌服蒸馏水，川楝子各剂量组分别灌服166，81，57，40，28 g/kg川楝子。1 h后，按“2.2”方法测定血清ALT，AST，计算脏器指数，另取一部分肝组织，用于观察组织形态学变化。
        2.4  统计方法使用SPSS 13.0统计软件Probit法计算LD50、LD99和LD1。Radit法对肝组织病理积分的数据进行统计分析。计量资料采用±s表示，使用SPSS 13.0软件进行统计处理，两组间比较采用t检验法，多组间比较采用单因素方差分析法。P<0.05或P<0.01为差异有显著性。
       3  结果
        3.1  口服LD50
        3.1.1  给药后的一般状况部分动物在给药后0.5～1 h出现腹腔震颤，活动减少，身体略发凉，气息微弱。继而，出现异常反应的小鼠部分死亡，死亡时间集中在给药后的4 h内。死亡小鼠肝脏肉眼检查可见有不同程度的颜色变深、表面粗糙等，胃肠道内容物充盈，肠壁充血，其余脏器未见有异常改变。存活的动物两便增多。给药12 h后部分有异常反应的小鼠可逐渐恢复正常。
        3.1.2  死亡情况正常组小鼠死亡为0；川楝子各组按剂量从低到高的死亡数依次为0，3，5，10。计算LD50为200 g生药/kg，95%可信限为192～212 g/kg；LD1为166 g/kg， 95%可信限为134～179 g/kg；LD99为244 g/kg， 95%可信限为226～307   g/kg。
        3.2  口服“毒性时效”关系
        3.2.1  对血清ALT，AST的影响给药后1～12 h，血清ALT，AST值均有不同程度的升高，与正常组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01）； ALT，AST值均在给药后1 h达到高峰，毒性持续时间约24 h。结果见表1。
        3.2.2  对肝、脾、胸腺脏器指数的影响给药6 h后即可出现肝脏明显肿大，肝指数升高，其中24 h肝脏指数升高最为明显；给药12 h后小鼠脾脏指数开始下降；给药24 h后小鼠的胸腺指数出现明显下降。结果见表2。
        3.2.3  对肝组织形态的影响光镜下观察，正常组肝小叶结构清晰完好，肝细胞未见明显变性、坏死，肝窦未见明显淤血扩张；给药24 h后，可见肝小叶结构尚正常，肝细胞水肿，出现气球样变，水肿变性广泛。积分统计结果表明，川楝子给药24 h后对肝组织产生明显损伤，与正常组比较有显著性差异(P<0.01)。结果见表3及图1～4。 表1  川楝子不同时间对小鼠ALT，AST的影响表2  川楝子不同时间对小鼠脏器指数的影响表3  川楝子不同时间给药后对小鼠肝组织形态的影响
        3.3  口服“毒性量效”关系
        3.3.1  对血清ALT，AST的影响川楝子81，166 g/kg剂量组ALT升高，与正常组相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，且呈剂量依赖性。结果见表4。
        3.3.2  对肝、脾、胸腺脏器指数的影响川楝子166 g生药/kg组有升高肝脏指数，降低脾脏、胸腺指数的趋势，但与正常组比较无显著性差异（P>0.05）。结果见表5。
        3.3.3  对肝组织形态的影响光镜下观察，正常组肝小叶结构清晰完好，肝细胞未见明显变性、坏死，肝窦未见明显淤血扩张；28g/kg组与正常组基本相同；40～166 g/kg组肝小叶结构尚正常，肝细胞可见混浊肿胀、脂肪变性或气球样变，散在点状坏死，偶见灶性坏死；积分统计结果表明，川楝子40～166 g/kg剂量组对肝组织产生明显损伤，与正常组比较有显著性差异(P<0.05)。结果见表6及图5～10。表4  川楝子不同剂量对小鼠ALT，AST的影响表5  川楝子不同剂量对小鼠脏器指数的影响 表6  川楝子不同剂量给药后对小鼠肝组织形态的影响
       4  讨论
        对川楝子致小鼠肝毒性时效关系的研究显示：小鼠单次灌服188 g/kg的川楝子后，血清ALT，AST值随时间的不同造成的肝损害的程度也不同，毒性高峰出现在给药后的1 h，持续约24 h；肝组织病理形态学检查显示川楝子给药24 h后可对肝组织产生明显损伤。这表明，单次给予较高剂量的川楝子可造成小鼠急性肝损伤，具体表现为血清ALT值升高甚或肝组织病理形态学的改变，且毒性出现早、持续时间短。
        对川楝子致小鼠肝毒性量效关系的研究显示，小鼠单次灌服较高剂量的川楝子后，可使血清ALT，AST值显著升高，且呈剂量依赖性。肝组织病理形态学检查显示给予较高剂量的川楝子后，肝细胞可出现不同程度的水肿、脂肪变性以及部分点状坏死，偶见灶性坏死；而灌服低剂量的川楝子后，肝组织病理形态学未见异常改变。这表明，灌服川楝子达一定剂量后，可致小鼠急性肝损伤，具体表现为血清ALT值升高甚或肝组织病理形态学的改变，且呈明显的量效关系。
        《名医别录》谓川楝子有小毒，但临床应用仍很广泛，现代对其毒性的研究较少。有临床研究表明消化道的不良反应大多在服药后1～2 h内出现，表现为胃肠道刺激症状，并可发生急性中毒性肝炎，出现转氨酶升高［2］。有人报道1例口服川楝子过量导致中毒的病例，毒性反应出现在服药后30 min左右，表现为恶心、呕吐、口干、心慌、燥热、小便不畅等症状［3］。实验研究显示，猴灌胃川楝子20 g/kg 3 d后，肝脏病理形态学检查显示猴肝细胞索离散、胞核消失，其毒性可随单次剂量增加而增加，作用慢而持久，且有蓄积性［4］。成年果子狸饲喂一定量的川楝子后，在短时间内即可引起中毒，主要表现为胃肠道刺激，肌肉震颤、四肢抽搐、肌无力等中枢神经系统症状，伴有肝脏为主的其他内脏器官出血［5］。本研究的结果表明川楝子单次灌服即可产生明显的肝脏毒性，表现为血清酶学和肝脏组织病理形态学的改变，与上述报道符合，因此，临床应用时应该引起重视。
        由于川楝子临床上以汤剂口服为主，为了能更安全地应用，了解其口服毒性特点，对其进行毒性研究显得尤为必要。本实验以川楝子水提醇沉液为研究对象，对其肝毒性的时效、量效进行了初步研究，关于其肝脏损伤的机制我们将进行进一步的研究。
       【参考文献】
         ［1］ 何桂霞，李 玲，肖锦仁，等.藤茶总黄酮对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用［J］.湖南中医学院学报，2004，24（4）：7.
       
       ［2］ 路志强.川楝子的性味功能与现代临床应用［J］.内蒙古中医药，1997，1：46.
       
       ［3］ 卓长贵，高 英，张雪美.川楝子口服过量致中毒1例［J］.中国社区医师，2005，13（7）：60.
       
       ［4］ 袁继丽.中草药致肝损害的研究近况［J］.中草药，1999，30(9)：712.
       
       ［5］ 刘进辉，曹迎春，李文平，等.果子狸川楝子中毒后的临床表现及病理变化［J］.特产研究，1996，3：28.