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       【摘要】 
       目的建立凝胶渗透色谱（GPC）净化-毛细管气相色谱测定中成药中有机氯农药残留量的方法。方法凝胶渗透色谱采用的流动相为丙酮-环己烷 (1∶4)，最佳流速是5 ml/min，最佳馏分收集时间是15～26 min。结果低、中、高3个添加水平的回收率分别为85.5%～115.0%，84.3%～123.4%，86.7%～114.0%，相对标准偏差（RSD）为0.1%～9.3%，检出限0.008～0.05μg/kg。结论该方法简便，分离效果好，灵敏度高，重现性好。
       【关键词】  气相色谱 凝胶渗透色谱 有机氯农药 中成药 残留量
       有机氯类农药(OCPs)是一类高效广谱杀虫剂，广泛应用于杀灭农业害虫，曾是各国杀虫剂中使用最广泛的一大类。这类农药化学性质稳定，脂溶性强，残效期长，易在脂肪体内蓄积，造成慢性中毒，严重危及人体健康，中药材及中成药的农药残留问题近年来逐渐引起人们的重视。尽快建立中药中农药残留的检测方法及限量标准，对保证人们用药安全具有积极的意义。目前中药材中有机氯农药残留测定主要采用有机溶剂提取，浓硫酸净化，气相色谱分析。但因中药成分复杂，其中农药残留量属痕量范畴，这样使得农药的提取、分离、净化与富集的难度加大。凝胶渗透色谱作为一种自动化的分离技术在农药残留分析中得到了推广和应用［1～7］。本研究运用凝胶渗透色谱替代硫酸净化，有效地克服了硫酸净化回收率偏低的难题，建立的毛细管气相色谱分析方法，具有操作简便、分析速度快、分离效能高、检测灵敏度高等优点，适合于中成药中痕量有机氯农药的测定。
       1  材料
        Agilent 6890N 气相色谱仪，配备捕获检测器（μ-ECD），安捷伦GC工作站。GPC纯化系统：泵（Waters 515 HPLC Pump ），二极管阵列检测器（Waters 2996 PAD）, 自动馏分收集器（Waters Fraction Collector III），GPC纯化柱（Shodex CLNpak EV2000，20.0 mmID×300 mm），数据处理软件（Waters Empower），5 ml定量环。OV-1701毛细管色谱柱30 m×0.32 mmID×0.32 μm；R210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI）；电子分析天平（R200D）。 
        丙酮、环己烷均为色谱纯（天津科密欧），二氯甲烷为分析纯（天津科密欧）。农药标准品：甲体-六六六（α- BHC）；乙体-六六六（β- BHC）；丙体-六六六（γ- BHC）；丁体-六六六（δ- BHC）；对对位滴滴依（PP`-DDE）；邻对位滴滴涕（OP-DDT）；对对位滴滴滴（PP`-DDD）；对对位滴滴涕（PP`-DDT）；五氯硝基苯（PCNB）。所用标准品由中国成都化学试剂生产，纯度大于99%。用甲醇分别配成0.1 mg/ml的单标储备液，再分别移取一定量的单标储备液于10 ml容量瓶中，用丙酮-环己烷（1∶4）混合液定容，配成混合标准液。
       2  方法
        2.1  样品的提取 准确称取仙灵骨葆胶囊样品（胶囊直接取其粉末即可，颗粒须经磨碎成粉末） 2.5 g于具塞锥形瓶中，加入10 ml水浸泡过夜或超声30 min，加丙酮30 ml超声30 min，加3 g氯化钠，振摇，再加30 ml二氯甲烷，超声30 min，静置1～2 h，取30 min上清液于100 ml浓缩瓶中，在50℃旋转蒸发浓缩近干，再加丙酮-环己烷（1∶4）混合液5 ml，重复2次，用丙酮－环己烷混合液定容至10 ml，4 000 r/min离心10 min待用。
        2.2  GPC凝胶净化实验
        2.2.1  GPC洗脱规律实验取5 ml一定浓度的农药混合标准液进样，用Waters 2996 PAD进行全波长扫描，以丙酮－环己烷（1∶4）混合液作流动相， 流量5 ml/ min，每毫升收集于一个试管中，收集30个，用氮吹近干，丙酮－环己烷定容至1 ml得到待测液1。同样在做成药洗脱曲线时，用带0.45 μl尼龙微孔滤膜的10 ml的注射器取样品提取液5 ml过GPC，其余同上，得到待测液2。
        2.2.2  GPC净化取“2.1”项的提取液5.0 ml进样到GPC；保持流速为5 ml/ min，收集第15～26 min馏分。浓缩淋洗液,用丙酮－环己烷定容至5 ml待测，得到待测液3。
        2.3  GC分析条件Agilent 6890N 气相色谱仪，配备捕获检测器（μ-ECD），ov-1701弹性石英毛细管色谱柱30 m×0.32 mmID×0.32 μm；进样口280℃，柱温220℃，检测器370℃，载气为高纯N2（纯度99.99%），柱前压105 KPa，柱流量1.5 ml/min，进样量1 μl，不分流进样。
       3  结果
        3.1  净化条件的确定馏分收集时间点的确定要充分考虑被渗透排除的机体组分与混合标准组分的分离情况和回收率。成药样品和农药混合标准经GPC净化后GC-ECD检测结果表明，收集第15～26 min的馏分，成药（仙灵骨葆胶囊，贵州同济堂制药有限责任公司生产）样品净化率可达70%，加标回收率为85%～115%，回收率满足痕量分析的要求，成药样品色谱图见图1。
        3.506 min为α- BHC，3.77 min为PCNB，5.94 min为β- BHC
        图1  成药样品GC-ECD色谱图
        3.2  成药及9种有机氯农药的GPC流出规律GPC是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应进行分离，大分子的油脂、色素(叶绿素、叶黄素)、生物碱、聚合物等先淋洗出来，农药及工业污染物等分子量较小，后淋洗出。GPC凝胶柱对成药以及9种有机氯农药的分离、净化效果进行如下试验。将待测液1分别用Agilent 6890N 气相色谱仪，电子捕获检测器（μ-ECD）检测出各段流出农药的含量，结果见图2。9种有机氯农药在凝胶渗透色谱柱上都是在第15～26 min时流出，但在第15 min仅有δ- BHC和第26 min有PCNB流出少量，所以，在样品基质较复杂的体系中，只需收集16～25 min，这可最大限度去除油脂等杂质的干扰，回收率达到85%～115%。将待测液2分别用Agilent 6890N 气相色谱仪，电子捕获检测器（μ-ECD）检测出各段流出液杂质的含量，结果见图3。成药流出液杂质（油脂、色素、生物碱等）在凝胶渗透色谱柱上是在第10～35 min流出，其中10～15 min时流出 50%的杂质，第15分钟收集的馏分在ECD上响应值最高，第900分收集的馏分在ECD上有响应。
        图2  9种有机氯农药的GPC流出规律    图3  仙灵骨葆胶囊的GPC流出规律
        3.3  标准工作曲线和方法学评价配制5个不同浓度的混合标准溶液，每个浓度重复3次，取峰面积平均值，得线性回归方程，见表1。有机氯农药标准品色谱图见图4。从表1得出，在一定的浓度范围内，9种有机氯农药的线性关系良好，线性关系系数r（0.998 9～0.999 7）。加标样品按3倍基线-噪声比计算9种有机氯农药的检出限。
        3.4  回收率及精密度实验在2.5 g成药样品中加入3种不同浓度（添加水平见表2）有机氯混合标准液，按上述方法进行，同时做空白对照，回收率及相对标准偏差结果见表2，成药加标GC-ECD色谱图见图5。 表2  回收率与精密度测定结果
        3.5  样品测定按照本文建立的方法，测定了贵州省出口潜力较大的3种中成药，农药残留测定结果见表3。结果表明，贵州中药有机氯农药的残留自实行中药药材规范化种植以来，中药中有机氯农药污染已得到了控制。表3  3种成药中有机氯农药的残留量mg·kg-1 H1-仙灵骨葆胶囊（批号：060428），贵州同济堂制药有限责任公司生产；H2-抗妇炎胶囊，贵州远程制药有限责任有限公司生产（批号：Z20025698）；H3-妇科再造丸（批号：Z20025056），贵州德昌祥药业有限公司生产。“-”表示未检出
       4  讨论
        本文以贵州出口中成药仙灵骨葆胶囊为样品，系统地研究了其提取液和有机氯农药的GPC流出规律，建立了仙灵骨葆胶囊中有机氯农药残留的测定方法，并成功地运用于其他中药的测定。建立的GPC净化，气相色谱测定中成药中有机氯农药残留量的方法具有自动化程度高，回收率和净化效率好等优点，适合于大部分中成药中9种有机氯农药的测定。但对于含糖组分较高的中成药，如糖浆类成药，本文建立的样品提取方法不适用，有待进一步研究。
       【参考文献】
         ［1］ 刘咏梅，王志华，储晓刚. 凝胶渗透色谱技术在农药残留分析中的应用［J］.分析测试学报, 2005, 24(2)：123.
       
       ［2］ 刘咏梅, 王志华, 储晓刚. 凝胶渗透色谱净化-气相色谱分离同时测定糙米中50种有机磷农药残留［J］.分析化学，2005，33(6)：808.
       
       ［3］ 李 樱，储晓刚，仲维科，等.凝胶渗透色谱气相色谱同时测定糙米中拟除虫菊酯有机氯农药和多氯联苯的残留量［J］.色谱，2004，22（5）：551.
       
       ［4］ 曾凡刚.凝胶渗透色谱净化：气相色谱法测定牛奶中10种有机氯农药残留［J］.中国乳品工业，2006，34（5）：52.
       
       ［5］ 高梦南，王燕萍，唐红卫，等.凝胶渗透色谱净化在土样有机氯测定中的应用［J］.环境科学与技术，2006，29（3）：38.
       
       ［6］ 李 樱，储晓刚，仲维科，等.凝胶渗透色谱和固相萃取净化-气相色谱分离组合法测定糙米中的残留农药［J］.分析化学，2004，32（10）：1325.
       
       ［7］ Waters公司北京实验室.Waters高效GPC分级净化系统:复杂环境样品分级的有效工具［J］.环境化学，1999，18（2）：188.