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       【摘要】 
       目的诱导青蒿四倍体，筛选出最佳诱变条件。方法 采用两种方法对材料进行诱变。幼苗浸泡法：秋水仙素溶液浸泡青蒿幼苗，药液浓度和浸泡时间以及处理温度呈梯度设置；萌动种子浸泡法：秋水仙素溶液浸泡青蒿萌动种子，药液浓度呈梯度设置。然后对所得幼苗根尖染色体镜检，结合植株外形和气孔保卫细胞的特征，确定其诱变率。结果幼苗浸泡法中，以15℃下，0.2%秋水仙素处理96 h为宜，诱变率30%。萌动种子浸泡法中，以25℃下3～5 mg/L秋水仙素处理120 h为宜，诱变率45%～96%。结论萌动种子浸泡法优于幼苗浸泡法。
       【关键词】  四倍体 秋水仙素 染色体
       青蒿Artemisia annua L．，又名黄花蒿，是菊科一年生药用草本植物。其提取物青蒿素对脑疟疾和氯喹疟疾具有高效低毒的抗疟性能，WHO已经认定复方青蒿素成药为目前最安全有效的抗疟药。现在世界上已经有51个国家和地区在WHO推荐下将其列为抗疟指定用药，这使得全球对青蒿素原料的需求猛涨，从2004年开始已出现了从原料到成品药各个环节的严重供货短缺。国际市场上的青蒿原料价也从每吨240美元上涨到700美元［1］。目前该药物虽然能人工合成，但成本很高，未能产业化［2］，工业上主要从青蒿植株中提取。目前青蒿因长期处于野生状态，未能选育出高含量的品种，而且其含量还受土壤营养、栽培措施、气候等多种因素影响［3,4］，因此大大增加了该药的生产成本。为此，高青蒿素含量的青蒿品种选育工作重要性日益凸显，多倍体育种正是选育优良品种的一个重要思路。本实验初步研究了秋水仙素诱变青蒿多倍体的最佳实验参数，为进一步的育种工作打下基础。
       1  材料
        秋水仙素购自上海国药集团化学试剂有限公司（进口分装）；种子采自重庆酉阳本地栽培品种。
       2  方法
        2.1  幼苗浸泡法种子在沙床上培养10 d，发芽至约0.5 cm高后待用。
        2.1.1  秋水仙素溶液处理浓度和时间对诱变率的影响研究每处理20株苗。秋水仙素溶液浓度如下：0.02%，0.05%，0.2%，0.5%，0.02%+2%DMSO，0.05%+2%DMSO，0.2%+2%DMSO，0.5%+2%DMSO；处理时间（h）:24，48，72，96，120；处理温度：15℃；ck：清水浸泡。
        2.1.2   处理温度对诱变率的影响研究每处理50株苗，秋水仙素浓度0.5%，处理时间72 h，设如下温度处理： 15，20，25，30℃。
        上述两研究均将小苗在秋水仙素溶液中浸泡，每浸泡24h取出在空气中恢复1h后再继续浸泡，以免小苗因缺氧死亡。处理完毕后清水漂洗，在光照培养箱内湿滤纸上恢复培养3 d后，移栽小花钵。
        2.2  萌动种子浸泡法每处理萌动种子100粒，秋水仙素溶液浓度（单位：mg/L）：1 000，800，600，400，200，60，40，20，5，3，1，0.5，0.3，0.1；温度：25℃；ck：清水浸泡。
        种子在湿滤纸床上培养2～3 d，在解剖镜下挑取露白种子，置于放有滤纸的平皿上，加入以上浓度秋水仙素溶液4 ml/皿，以滤纸润湿而未完全淹没种子为宜，置于光照培养箱中培养。5 d后，统计发芽率和诱变率。
        2.3  比较所得盆栽四倍体青蒿植株和二倍体的生理特征四倍体和二倍体植株各取5株，作以下测量：（1）测定其高度和地面以上第二节茎粗；（2）取植株从下至上第4片复叶的顶叶，用游标卡尺测定叶片厚；（3）在显微镜下测定(2)中叶片的气孔细胞叶绿体个数，每张叶片测10个气孔。气孔长度的测量采用印迹法［5］。具体方法如下：用蒸馏水擦洗叶片下表面后，在叶片的下表面中部约1 cm×3 cm大小的面积上均匀涂上一层无色指甲油，待指甲油干燥后，将指甲油膜取下。将膜与叶片接触的一面向下置于载玻片上，盖上盖玻片，在640倍镜下随机观察10个气孔，用标定好的目镜测微尺测量气孔长度。（4）取根尖在0.2%秋水仙素液中处理2 h，卡诺氏固定液固定6 h，梯度酒精漂洗后用盐酸：酒精液解离5 min，蒸馏水洗净，卡宝染液染色5 min，镜检观察染色体。
       3  结果
        3.1  不同秋水仙素浓度和不同处理时间对诱变率的影响见表1。当药液浓度一定时随着处理时间延长，诱变率增加。当处理时间一定，随着药液浓度的增加，诱变率增加。当处理时间和秋水仙素浓度一定时，秋水仙素溶液中添加了DMSO的处理与未添加DMSO的处理相比，诱变效果无明显变化。据报道，DMSO具有促进细胞通透性，增大秋水仙素吸入量的作用，本实验未得到这一结果。虽然诱变时间延长和秋水仙素浓度增加可增加诱变率，但小苗存活率随之下降，且移栽大田后畸形苗比率增加。另外，同样的处理浓度和时间，添加了二甲基亚砜的小苗死亡率和畸苗率均有一定程度增加，可见其对小苗有一定毒害。综合以上因素考虑，以0.2%秋水仙素处理96 h为宜。表1  不同秋水仙素浓度和不同处理时间对诱变率的影响
        3.2  处理温度对诱变率和存活率的影响见表2。处理温度升高，诱变率下降。这是因为植株存活率在一定范围内随温度增高而下降。实验中发现，当处理温度较低时，小苗色泽鲜绿，茎叶挺拔，处理后存活率高；当处理温度较高时，小苗颜色黯淡、茎叶发软而死亡。表2  处理温度对小苗存活率和诱变率的影响
        3.3  秋水仙素处理萌动种子诱变率见表3。从上表可以看出，秋水仙素浓度3 mg/L是个阈值，低于这个浓度，青蒿种子生长发育不受影响，所得小苗形态同对照无差别：茎细长，生长迅速。而在3～20 mg/L这一范围，诱变率随秋水仙素浓度升高逐渐增加，所得小苗叶色深绿，茎明显比对照粗，靠近子叶处茎略膨大，而移栽成活率随秋水仙素浓度增加降低，大于20 mg/L，苗不长根，茎极度膨大呈球形，移栽不能成活。综合各因素考虑，适合的诱导条件是：秋水仙素浓度3～5 mg/L，120 h。
        3.4  二倍体和四倍体青蒿植株的形态比较结果如表4和表5，植株染色体图片见图1和图2。对表5气孔长度进行方差分析，F=297.424，P<0.01，表明二倍体和四倍体间差异极显著。表3  不同秋水仙素浓度对萌动种子诱变率的影响 表4  盆栽二倍体和四倍体青蒿植株的形态比较 染色体数目/个二倍体植株生长正常，叶片较薄，正常绿色，边缘略向上翘，叶脉突起不明显，节间较长60.50.021.78118～9月18四倍体植株生长缓慢，叶片增厚，呈深绿色，边缘略下卷，叶脉明显突起，节间缩短，茎粗壮3.50.031.95 1410～11月36表5  二倍体和四倍体青蒿植株的气孔细胞长度比较
       4  讨论
        倍性育种是中药材育种的一条重要途径。由于药材一般利用其特定器官，而多倍体大多具有器官“巨大性”的特点，所以有利于提高药材产量。同时，由于细胞染色体加倍，染色体上基因调控产生的有效化学成分含量往往较正常二倍体高，对于提高药材质量十分有利。另外，据观察，四倍体青蒿植株比二倍体茎杆粗壮，因此抗倒伏能力增强。
        增加秋水仙素浓度和延长处理时间都可以提高诱变率，但实际试验中只能把浓度和时间限制到一定范围内，否则会对材料造成毒害，影响苗成活和正常发育。
        图1  四倍体根尖染色体      图2  二倍体根尖染色体
        处理温度对秋水仙碱的作用具有一定影响［6］，温度越高，秋水仙碱渗透到植物体内的机会就越大，诱导效果就越明显。但是温度升高，往往会导致材料生活力下降，因为在一定范围内，植物的呼吸作用随温度升高而增强，但此时幼苗正处于缺氧状态，只能进行无氧呼吸，产生大量乙醇，对组织造成毒害。而温度过低又会冻伤植物，且其新陈代谢随温度降低减弱，也不利于秋水仙素发生作用。一般认为适合的温度为15℃左右。同时综合药液浓度与处理时间考虑，认为温度低时药液浓度可稍大，处理时间可稍长些，温度高时则降低药液浓度，缩短处理时间［7，8］。
        青蒿两片子叶期的幼苗生长点外露，利于诱变，但采用传统的点滴法或棉花包埋法费时费工，且容易把幼嫩的小苗压断。本实验采用幼苗和萌动种子浸泡法，可以一次性处理大批小苗，提高了工作效率。小苗长时间浸泡在诱变液中，氧气缺乏，药剂毒害过大，死亡率和畸苗率均会增加，每天取出在空气中放置一段时间，有利其生活力恢复。在种子浸泡法中，如果不将种子预先在滤纸床上培养，挑取萌动露白种子，而直接用秋水仙素溶液浸泡干种子，很可能会由于种子间的生理差异，其萌动时间参差不齐，导致即使浸泡时间一样，而秋水仙素作用时间不一致，产生实验误差。
        幼苗浸泡法和萌动种子浸泡法比，后者较前者更好。首先，种子浸泡法利用低浓度的秋水仙素就能产生高诱变率，所需秋水仙素浓度仅是幼苗浸泡法的数百分之一，节约成本，对材料造成的伤害小；其次，采用幼苗浸泡法诱变后的幼苗很难同未诱变株区分，只能通过根尖细胞染色区别，而诱变后的种子萌发的幼苗茎膨大，明显有别于对照，便于在早期进行甄选；第三，种子幼胚比小苗幼嫩，细胞代谢更活跃，有利于秋水仙素发挥作用；第四，种子在含秋水仙素的平皿上萌发，是有氧呼吸，可承受较高温度，而高温有利于秋水仙素渗透到组织深处。综合以上分析，种子浸泡法优于幼苗浸泡法。
       【参考文献】
         ［1］ 中国中医药信息杂志通讯员.世界卫生组织呼吁中国增加青蒿素产量［J］.中国中医药信息杂志, 2005，12（8）：110.
       
       ［2］ 许杏样，朱 杰，黄大中，等.青蒿素及其一类物结构和合成的研究［J］.有机化学，1983，41（6）：574.
       
       ［3］ Schmid G．Total synthesis of Qinghaosu［J］．J Am．Chem．Soc．1983，105：624.
       
       ［4］ 韦 霄，李 锋.不同栽培措施对黄花蒿产量和青蒿素含量的影响［J］.广西科学院学报，1999，15（3）：132.
       
       ［5］ 傅德明，蔡正江，毛禄国.青蒿生物学特性及规范化栽培技术［J］.中国农技推广，2005，21（12）：34.
       
       ［6］ 张秀芳，石东里，张 兰，等.观察植物气孔结构的简易方法［J］.生物学通报，2002，37（6 ）：42.
       
       ［7］ 石荫坪，李雅志.果树突变育种［M］.上海：上海科学技术出版社，1986：226.
       
       ［8］ 谭德冠 ，庄南生，黄华孙.组织培养与秋水仙碱诱导相结合培育植物多倍体的应用［J］.亚热带植物科学，2005，34（1）：70.