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       【摘要】 
       目的观察刺五加多糖（ASPS）对H2O2诱导海马神经元氧化应激损伤及细胞凋亡相关基因－2（Bcl-2）家族的影响，并探讨其可能机制。方法运用海马神经细胞原代培养技术，采用H2O2诱导建立细胞氧化损伤模型。观察细胞形态学变化；MTT法测定细胞活性；TUNEL法，检测H2O2诱导大鼠海马神经元凋亡；免疫组化法检测细胞中Bcl-2，Bax蛋白表达；化学比色法检测细胞匀浆液中一氧化氮合酶（NOS），过氧化物歧化酶（SOD）的活性及丙二醛（MDA）含量。结果形态学观察显示：与模型组比较，ASPS组细胞损伤程度明显减轻；ASPS组细胞活性比模型组细胞活性高； TUNEL 法显示ASPS预处理组细胞阳性率明显高于模型组细胞；ASPS组Bcl-2表达量较高而Bax表达量较低； NOS活力及MDA生成量ASPS组明显低于模型组，但SOD活力ASPS组显著高于模型组。结论ASPS能提高海马神经细胞的抗氧化应激损伤能力并上调Bcl-2基因表达，下调Bax表达。
       【关键词】  刺五加多糖 海马神经细胞 氧化应急损伤 细胞凋亡相关基因-2家族
       自由基是一类具有不配对电子的活泼化学基团。其中氧自由基和氮氧自由基是与生命或健康相关的主要自由基类型。这些自由基可与许多生物大分子发生氧化损伤反应。目前认为衰老、炎症、癌症、白内障、心血管疾病以及阿尔茨海默症、帕金森症等神经退行性疾病都与自由基氧化损伤有关。抗氧化、减少过多的自由基产生或促进机体产生内源性抗自由基物质、提高机体对自由基氧化损伤的自我保护能力，可在一定程度上预防相关疾病的发生或改善证候。因此，筛选和开发抗自由基物质受到医药界的广泛关注。本实验室通过采用H2O2诱导海马细胞氧化损伤模型，观察刺五加多糖对抗氧化酶和凋亡基因的影响。
       1  材料
        1.1  药品  刺五加多糖（Acanthopanax senticosus polysaccharide，ASPS）粉末，由湖北省中医药研究院新药研究室提供。
        1.2  试剂  MTT购自Amersco公司；阿糖胞苷购自Sigma 公司；胰蛋白酶、DMEM高糖培养基、胎牛血清、B27均购自GIBCO公司；兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶抗体（NSE）、Bax和Bcl-2 抗体，sABC以及TUNEL试剂盒均购自武汉博士德生物公司；NOS，SOD和MDA试剂盒均购自南京建成生物公司。
        1.3  动物  SD孕鼠由湖北省医学实验动物中心提供，动物生产合格证号：SCXK（鄂）2003－0005。
       2  方法
        2.1  大鼠海马神经细胞原代培养及实验分组［1,2］无菌条件下取出生3 d 以内的乳大鼠脑组织，分离海马，剪碎，0.25%胰蛋白酶37℃，消化20～25 min，用接种培养液中止消化，吹打分散细胞，并用200目的滤筛过滤制成细胞悬液，调整细胞数至1×106个·ml-1，将细胞悬液按每孔100 μl接种于96孔板，每孔2 ml接种于6孔板。将板置于37℃，5% CO2培养箱中培养24 h后，更换培养液，用含2% B27的无血清培养液继续培养， 第3天换用含1%的阿糖胞苷培养液抑制杂细胞生长，以后每隔3 d换液1次，细胞培养至7 d时供实验用。实验共分为6组：阴性对照组、模型组和4个ASPS组（终浓度分别为10，5，2.5，1.25 μg·ml-1）。阴性对照组整个培养过程不加入任何处理因素，其余5组细胞培养至第7天时，加入终浓度为1 mmol·L-1的H2O2以制作损伤模型。
        2.2  海马神经细胞鉴定 取生长有海马细胞的盖玻片，冰丙酮固定，免疫组织化学染色，加入0.3% H2O2甲醇，以除去内源性过氧化氢酶，正常羊血清封闭20 min，加入兔抗鼠NSE抗体（1∶50），4℃冰箱过夜，PBS 洗涤3次，生物素化山羊抗兔IgG（1∶100）37℃孵育 20 min，PBS 洗涤3次， DAB显色，复染，脱水，透明，封片，光镜观察。
        2.3  海马细胞H2O2损伤模型的建立 取培养7 d的海马神经细胞去除原培养液后，损伤组加入无血清培养液DMEM，加入终浓度为1 mmol·L-1的 H2O2培养 1 h 后，DMEM洗2次，换上无血清的DMEM培养液，置于37℃，5% CO2培养箱中继续培养24 h。
        2.4  形态学观察 倒置显微镜观察神经元的生长状态及形态的变化，并拍摄原代培养的海马神经细胞。
        2.5  MTT法测定海马细胞活性［3］细胞培养与造模方法均同前，在H2O2损伤前24 h 给药各组按实验设计给药，然后再加入H2O2损伤。实验结束前 4 h 加入 25 μl MTT（终浓度为1 mg·ml-1），吸去培养液，每孔加入二甲基亚砜 150 μl，待孔内颗粒完全溶解后，用酶标仪测定570 nm 处的光密度（OD）。
        2.6  TUNEL法检测凋亡细胞 应用细胞爬片技术，按上述进行实验分组，细胞培养至第10天取出细胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min，自然晾干。用PBS洗涤2次，5 min/次，应用TUNEL试剂盒检测凋亡细胞。参照阳性切片，辨出凋亡细胞，随机10个视野，每个视野数500个细胞，记录每个视野中凋亡细胞数，算出细胞凋亡率。
        2.7  海马细胞中Bcl-2与bax表达量的测定［4］应用细胞爬片技术，按上述进行实验分组，细胞培养至第10天取出细胞爬片，冰丙酮固定30 min，自然晾干。用0.3% H2O2甲醇溶液，除去内源性过氧化氢酶；洗涤，10%羊血清封闭20 min；加入一抗（1∶100兔抗鼠Bax、Bcl-2抗体）4℃冰箱过夜；PBS洗涤 3 次；二抗（1∶100生物素化山羊抗兔）37℃孵育 20 min；PBS洗涤3次；DAB显色，复染，脱水，透明，封片。每张免疫组化片随机10视野，采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，选用阳性单位（positive unit，PU）指标定量表达免疫组化阳性反应。
        2.8  匀浆液的制备及各生化指标的测定
        2.8.1  匀浆液的制备用预冷的高盐细胞裂液1 ml加入1×107个细胞·ml-1，0℃温预20 min，取出细胞裂解液，分装保存在-80℃条件下。
        2.8.2  NOS 活力的测定NOS催化L-Arg和分子氧反应生成NO，NO与亲核性质物质生成有色化合物，在530 nm波长下测定吸光度根据吸光度大小计算出NOS的活力。具体操作参照NOS试剂盒说明书。
        2.8.3  SOD 活力的测定 黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O-2·），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显示剂下成紫红色，当样品中含有SOD时，则对O-2·有专一性的抑制，颜色变浅，通过公式计算出样品中SOD的活力。具体操作参照SOD试剂盒说明书。
        2.8.4  MDA含量的测定氧化脂质产物MDA能够与硫代巴比妥酸（TAB）缩合，形成红色产物，通过比色法在532 nm测出MDA的含量。具体操作参照MDA试剂盒说明书。
        2.9  统计学处理与分析 实验数据以±s表示，通过统计软件SPSS8.0进行显著性检验用单因素方差分析及t检验。
       3  结果
        3.1  海马细胞生长状况及染色鉴定 培养10 d神经元相互之间，神经元和非神经元（主要是星形胶质细胞）之间形成相互联系，连接成紧密的网络，神经元主要生长在非神经元之上。免疫细胞化学染色证实培养的细胞即为神经细胞。见图1。
        图1  NSE免疫组织化学染色（40×）
        3.2  形态学观察
        3.2.1  对照组神经元胞体饱满，周围有光晕，轴、树突细长明显，交织成网络，见图2。
        3.2.2  模型组神经元胞体皱缩，周围光晕下降，轴、树突断裂，并延突起方向出现大量空泡，见图3。
        3.2.3  ASPS组当ASPS终浓度为10，5，2.5 μg·ml-1时，神经元形态有所改善，较多细胞保留轴、树突，但仍见凋亡或坏死细胞。当ASP终浓度为1.25 μg·ml-1时，神经元损伤严重，较模型组改善不大，见图4～7。
        3.3  ASPS对海马细胞活性的影响 神经元经H2O2损伤后，细胞活性明显下降，与对照组相比较，有显著性差异（P<0.01），表明模型复制成功。分别用10，5，2.5，1.25 μg·ml-1ASPS与海马神经细胞共孵育后，除1.25 μg·ml-1组外，其余各ASPS组神经元活性提高，与模型组相比较，具有显著性差异（P<0.01或P<0.05）见表1。
        3.4  ASPS对受损海马细胞凋亡率的影响 从表1可见，与正常组比较，模型组细胞凋亡率明显升高，细胞经ASPS预处理后，细胞凋亡率下降，特别是10，5，2.5μg·ml-1 3个剂量组与模型组比较细胞率显著下降。   表1  各组细胞活性（OD表示）及细胞凋亡率 与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
        3.5  ASPS对海马细胞Bcl-2与Bax蛋白表达的影响 从表2可见，经ASPS共同培养后，海马细胞Bcl-2表达明显增强，Bax表达明显降低，其中10，5，2.5 μg·ml-13个剂量组与模型组比较，有显著性差异（P<0.01或P<0.05）；而1.25 μg·ml-1组Bax与Bcl-2表达与模型组比较无统计学意义。表2  各组细胞Bcl-2与Bax的PU值 与模型组比较，*P<0.05，**P< 0.01
        3.6  ASPS对海马细胞生化指标的影响从表3可见，与正常组相比，H2O2损伤组海马细胞内NOS（U·μgp-1）、MDA（nmol·μgp-1）（P<0.01）含量明显增高，SOD（U·μgp-1）（P<0.01）活性明显下降。采用ASPS预处理，ASPS前3个剂量组的细胞内SOD活力升高，与损伤组相比，具有显著性差异；细胞内MDA含量及NOS活力 ASPS 3个剂量组与损伤组比较明显下降；当ASPS浓度为1.25 μg·ml-1时，细胞内抗氧化酶活力下降细胞氧化受损严重。表3  各组细胞匀浆液中NOS，SOD活力及MDA的生成量变化与模型组比较，*P<0.05，**P< 0.01
           4  讨论
        机体在代谢过程中，会产生大量的活性氧，如果活性氧的产生和清除失去平衡，导致活性氧在体内大量积累，就会产生氧化应激损伤。由于神经组织的生理生化的特殊性质，对活性氧较为敏感，易遭受活性氧的攻击［5］。目前许多学者认为阿尔茨海默症、帕金森症等多种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的神经退行性疾病，都与活性氧有关［6～8］。在活性氧的损伤下，细胞膜通透性增加，DNA断裂损伤，激活凋亡基因。其中Bax基因表达上调，Bcl－2基因表达下调，细胞发生凋亡。
        本实验采用大鼠海马细胞原代培养，以H2O2诱导制作神经细胞氧化损伤模型，用ASPS作为保护性药物。本研究结果显示，与正常组比较，模型组神经细胞Bax蛋白表达显著上升，Bcl－2蛋白表达显著下降，在ASPS预保护组中，ASPS终浓度为10，5，2.5 μg·ml-1时，细胞活性较高，Bcl－2蛋白表达较强，Bax蛋白表达较弱。与正常组比较，模型组细胞中SOD活力较低，NOS活力和MDA的含量较高，并具有统计学意义。与模型组比较，在ASPS预保护组中，ASPS终浓度为10，5，2.5 μg·ml-1时，SOD活性较高，NOS活力和MDA的含量较低，并具有统计学意义。据以上实验推测，ASPS可能是通过抗氧化途径、抑制凋亡途径，从而达到减轻神经元损伤，但ASPS抗氧化作用的分子机制有待于近一步研究细化。
       【参考文献】
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