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       【摘要】 
       目的 探讨田基黄对急性肝损伤防治作用的药理机制。方法以四氯化碳（CCl4）制备小鼠急性肝损伤的模型，田基黄水煎剂灌胃，检测小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)活力以及一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6的含量，观察肝组织的病理损伤程度。结果不同浓度的田基黄能不同程度地降低CCl4所致异常升高的小鼠血清中的ALT，AST，NO，TNF-α，IL-6含量，升高SOD活性，并且改善肝脏组织的病理损伤。结论田基黄对CCl4所致小鼠肝损伤具有防治作用，其作用机制可能与降转氨酶、提高抗氧化能力和抑制NO，TNF-α，IL-6过量生成等有关。
       【关键词】  田基黄；四氯化碳；肝损伤；抗氧化；细胞因子
       The Protective Effect of Hypericum japonicum against Acute Liver Injury in Mice
       LIN Jiumao, ZHAO Jinyan, ZHOU Jianheng, CHEN Xiaofeng, YE Hongzhi, WANG Ruiguo
       1.Fujian College of Traditional Chinese Medicine & Fujian Academy of Integrative Medicine，Fuzhou，Fujian 350108，China；
       2. Fujian College of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou，Fujian 350108，China
       Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of Hypericum japonicum against acute liver injury in mice and its mechanism. MethodsAfter acate liver injury model was induced by carbon tetrachloride (CCl4) , mice were administrated intragastrically with  Hypericum japonicum.The serum ALT, AST, SOD, NO, TNF-α, IL-6 were determined and pathological change of liver was observed．ResultsHypericum japonicum could significantly decrease the elevation of serum ALT, AST, NO, TNF-α, IL-6 induced by CCl4，and increase SOD activity，ameliorate the pathological injury of liver．ConclusionHypericum japonicum shows protective effect against experimental liver injury in mice．Decrease the serum ALT and AST, increaseing anti-peroxide, restraining produce of the serum NO, TNF-α and IL-6,  may be one of its mechanisms．
       Key words:Hypericum japonicum；  Carbon tetrachloride；  Haste liver injury；  Antioxidation；  Cell factor
       
       田基黄原名地耳草，系藤黄科金丝桃属植物地耳草Hypericum japonicum Thumb的干燥全草。味甘、微苦，性凉，归肝、胆、大肠经。具有清热利湿、散淤止痛、消肿解毒的功效［1］。生于田野较湿润处，广布于长江流域及其以南各地，主产于江西、福建、广东、广西、四川、贵州等地。含有黄酮类、内酯类、色原烯类、缩二氨酸衍生物、咕吨酮类、间环己三醇衍生物等化合物［2］。现代药理研究表明，田基黄具有抑菌、抗病毒、保肝、抑制癌细胞、增强免疫、抗氧化、止血以及对心血管的双向调节等多种药理学功效［3］。为探讨田基黄保肝降酶的作用机制，本实验采用了CCl4诱导小鼠急性肝损伤的动物模型，对其进行研究观察。现将田基黄保护CCl4所致小鼠急性肝损伤的药理作用机制的研究结果报道如下。
       1  器材
       1.1  动物清洁级昆明种健康小鼠60只，体重18～22 g，雌雄各半，动物由福建中医学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK（闽）2005-0003，正常喂养，置实验室适应环境3 d后进行实验。
       1.2  药材与试剂
       田基黄购自福建中医学院国医堂医院，并经鉴定为藤黄科植物田基黄的全草；四氯化碳（CCl4），上海中国联化化工试剂有限公司产品，批号20051022，分析纯；生理盐水注射液，福州福药制药有限公司产品，批号050103A07；AST，ALT，NO，SOD，MDA测试药盒，南京建成生物工程研究所产品；TNF-α、IL-6试剂盒，解放军总医院科技开发中心放免所产品。
       1.3  仪器
       LXJ-2B低速大容量离心机、DDL-5低速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂产品；HH.W21>600电热恒温水浴箱，上海医疗器械厂产品；AB204-N电子天平，梅特勒公司产品；BT224半自动生化分析仪，意大利仪器；FJ-2008PS g放射免疫计数器，西安核仪器厂产品；BH-2系统显微镜，OLYMPUS公司产品。
       2  方法
       2.1  药物及试剂配制田基黄用冷水浸泡，煎煮2次，过滤，合并滤液，浓缩成含生药2 g /ml的水煎液，用前配成0.5，1.0，2.0 g/ml溶液，各以低、中、高剂量标之；将联苯双酯（BPD）滴丸配制成20 mg/ml的溶液；0.2% CCl4花生油溶液是用新鲜纯花生油作为溶剂按体积比配制。其他测试试剂按相关的药盒说明书进行配制。
       2.2  动物造模给药取小鼠50只，称重，按性别、体重随机分为5组（即空白组、CCl4模型组、田基黄低剂量组、田基黄中剂量组、田基黄高剂量组），每组10只，雌雄各半。空白组和CCl4模型组予以生理盐水灌胃，余各组予以田基黄低、中、高剂量提取物溶液灌胃，各组均按0.1 ml/10 g体重灌胃量给药，1次/d。于第1，4天在给药30 min后，空白组腹腔注射生理盐水，余各组腹腔注射CCl4溶液，各组按0.1 ml/10 g体重注射，正常喂养，连续7 d。
       2.3  取材于末次给药24 h后取材，摘眼球法取血约1ml，4℃ 3 000 r/min离心10 min分离血清，于-20℃保存待测；取血后处死小鼠，立刻剖开腹腔，暴露肝脏，剪取小块右叶中央部位肝脏组织，约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，迅速投入10%福尔马林溶液中固定，常规切片，HE染色，光镜下作组织病理学检查。
       2.4  指标检测各指标分别按相关的试剂盒操作说明书进行；肝组织病理学检查，在光镜下观察肝组织切片的病理形态学变化。肝组织病理学改变分为5级：正常肝细胞“-”;肝细胞点状坏死“+”；肝细胞灶状坏死“++”；肝小叶不足1/3肝细胞坏死“+++”；肝小叶超过1/3肝细胞坏死“++++”。
       2.5  数据统计处理采用SPSS12.0软件进行分析，计量资料，采用F检验，结果用±s表示；计数资料，应用Ridit检验。
       3  结果
       3.1  田基黄对小鼠血清中ALT，AST活性的影响
       模型组小鼠血清中的ALT和AST含量明显高于空白组(P<0.01)，表明模型制作成功；田基黄低、中、高不同剂量对CCl4所致转氨酶（ALT和AST）的升高具有显著的降低作用（与模型组比较，P<0.01）；而田基黄低剂量组降低ALT的作用尤为突出，但降AST的作用不同剂量间没有显著区别。结果见表1。表1 各组小鼠血清中ALT，AST活性的比较(略)
       3.2  田基黄对小鼠血清中SOD活性与NO含量的影响
       模型组小鼠血清中SOD含量明显低于空白组（P<0.01），NO含量明显高于空白组（P<0.01）。田基黄高、中剂量对CCl4所致的SOD活性降低具有显著的升高作用（与模型组比较，P<0.01），而田基黄低剂量对CCl4所致的SOD活性降低无显著性作用（与模型组比较，P>0.05）。田基黄低、中、高剂量对CCl4所致NO的升高具有显著降低作用（与模型组比较，P<0.05）。结果见表2。表2  各组小鼠血清中SOD活性与N0含量的比较(略)
       3.3  田基黄对小鼠血清中TNF-α，IL-6含量的影响
       模型组小鼠血清中TNF-α，IL-6含量明显高于空白组，提示肝脏受损伤时可导致血清TNF-α，IL-6含量增高。田基黄高剂量组对CCl4所致的TNF-α的升高具有明显降低作用（与模型组比较，P<0.05）；而中、低剂量也有一定的降低作用趋势，但没有显著性意义（与模型组比较，P>0.05）。田基黄低、中、高不同剂量对CCl4所致IL-6的升高具有显著的降低作用（与模型组比较，P<0.01）。结果见表3。表3  各组小鼠血清中TNF-α，IL-6含量的比较(略)
       3.4  田基黄对小鼠肝组织病理学损伤的影响
       组织病理学观察结果表明，空白组小鼠肝组织未出现明显病理变化。肝组织以中央静脉为中心向四周呈放射状排列且吻合成网，肝细胞之间的肝窦亦吻合成网，可见多个肝小叶及结缔组织构成的汇管区，肝细胞较大呈多边形，胞质嗜酸性。模型组小鼠肝细胞变性坏死严重，肝索排列紊乱，肝细胞广泛变性坏死，胞浆疏松化和气球样变；汇管区与中央静脉区肝细胞坏死相连呈桥接坏死，伴有大量炎性细胞浸润。模型组小鼠肝损伤严重程度与空白组比较有非常显著差异(P<0.01)，提示造模成功。各用药组肝细胞变性坏死程度明显减轻，与模型组比较有显著差异；与模型组比较，田基黄低剂量组有显著性差异(P<0.05)，余组均有非常显著性差异(P<0.01)。结果见表4。表4  田基黄对各组小鼠肝组织病理学损伤的影响（略）
       4  讨论
        本实验采用最常用的CCl4肝损伤的动物模型，指标明确，重复性好。CCl4进入机体后，产生一系列的化学反应，使肝细胞坏死，同时，肝脏由于CCl4攻击而受到损伤，使得转氨酶(ALT和AST)、炎症介质(NO，TNF-α和IL-6等)异常增高、SOD活性降低。其中，ALT和 AST是诊断肝胆系统疾病中应用最广泛的酶，是判断肝细胞受损害程度的敏感指标；SOD可阻止CCl4进入机体后生成三氯甲基自由基破坏肝细胞；在肝损伤中，各种炎症物质可诱导肝细胞产生并释放各种细胞因子，TNF-α，IL-6是重要的炎症反应介质，占有非常重要的地位，而TNF-α在体内也能诱导肝细胞合成IL-6，参与了肝炎的发病机制［4,5］。过量的NO本身可作为自由基或通过与自由基反应生成毒性更强的自由基等造成肝损伤，表现为细胞毒作用。已有大量的研究表明NO,TNF-α和IL-6在多种原因引起的肝损伤中起重要作用，因此抑制NO，TNF-α和IL-6的过量产生在肝损伤的防治过程中有重要的意义。
       
       实验研究结果表明，田基黄能明显抑制CCl4引起的小鼠血清ALT，AST活性的升高，增强机体抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制NO，TNF-α和IL-6的过量分泌，抑制NO的细胞毒作用，并对细胞因子介导的免疫性炎症反应性损伤具有保护作用，可保护和修复肝细胞病理学损伤，从而保护肝脏的结构和功能。提示这些可能是田基黄对CCl4所致肝组织损伤具有防治作用的部分药理作用机制。同时，本实验填补了田基黄在保肝、抗肝炎作用过程中，对一些细胞因子（NO，TNF-α和IL-6）影响的相关性研究的空白，同时为临床应用提供相关实验理论依据。
       【参考文献】
         　　［1］国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：598.
       
       ［2］傅芃，李廷钊，柳润辉，等．田基黄黄酮类化学成分的研究［J］.中国天然药物，2004，2(5)：283．
       
       ［3］林久茂，陈小峰，林明和. 田基黄的现代研究进展［J］.福建中医药，2004，35(6)：64.
       
       ［4］任 红，张定风．病毒性肝炎肿瘤坏死因子和自细胞介索6的改变［J］.中华内科杂志，1992，31(6)：344.
       
       ［5］黄健生，郭明秋．肿瘤坏死因子与乙型肝炎［J］.国外医学·流行病学传染病学分册，1995，22(5)：196.