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       【摘要】 
       目的 优选菟丝子多糖提取的最佳工艺并探讨菟丝子多糖在应激状态下对小鼠脑组织脂质过氧化物反应的影响。方法采用正交实验设计方法优选最佳工艺；比色法测定小鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量。结果影响菟丝子多糖提取率的主要因素为提取温度与料液比；不同剂量的菟丝子多糖均能降低MDA 的含量( P< 0. 05) ,并能增加SOD 的活性(P< 0. 05)。结论菟丝子多糖最佳提取工艺为超声提取，料液比为1∶15，提取温度为80℃，提取时间为60 min；菟丝子多糖具有抗脂质过氧化保护脑组织的作用。
       【关键词】  菟丝子； 多糖； 提取工艺； 脂质过氧化
       Optimum Extraction of Polysaccharides from Semen Cuscutae Established by Orthogonal Test and its Anti-peroxidation Effects on the Irritated Mouse Brain Tissues
       ZHANG Lijuan, ZHANG Yixin ,GU Tongnan ,ZHOU Xiuyan 
       Yanjing Medical College, Capital Medical University ,Beijing 101300，China
       Abstract:ObjectiveTo optimize and establish the extraction technology of water-soluble polysaccharides from Semen cuscutae and to inverstigate its anti-peroxidation effects on the irritated mouse brain tissues.MethodsThe orthogonal test was employed to test the effects of the three factors including volume of water, temperature of extrction and time of extration. The extraction technology was optimized. Malondialdehyde (MDA),superoxide dismutase(SOD)in the brain tissues were measured by colorimetry. ResultsThe extraction temperature and volume of water were significant factors. The decreased MDA levels were found in different dosage of polysaccharides from Semen cuscutae (P<0.05),and an increased SOD activity were obtained (P<0.05).  ConclusionThe optimum process is utrasonic extraction and the condition is as follows: the solid-liquid ratio is 1∶15, extraction temperature is 80℃, extraction time is 60 minutes. Polysaccharides from Semen cuscutae has anti-lipid peroxidation which is effective in protecting the brain tissues.
       Key words:Semen cuscutae;   Soluble polysaccharides;   Extraction technology;   Lipid peroxidation
        菟丝子为常用补益中药，具有补肝肾，益精髓，明目的功效，主治腰膝酸痛、遗精、消渴、尿有余沥、目暗等疾病［1］。2000版《中国药典》规定为旋花科植物菟丝子Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟种子，但在市场上其同属植物南方菟丝子Cuscuta australis R. Br.)已成为商品药材的主流品种［2］。近年来，菟丝子的研究多集中在对其黄酮类［3，4］和多糖［5，6］成分的研究，但利用超声提取菟丝子多糖的方法尚未见报道。脑组织脂质含量高，易受氧化损伤，有研究表明，脂质过氧化物在脑损伤的病理过程中起重要作用。本文采用正交分析的方法，设计并优化了菟丝子多糖超声提取工艺；并利用耐力游泳造成应激动物模型，通过测量脑组织SOD 和MDA 的含量，探讨菟丝子多糖对应激小鼠脑组织脂质过氧化物的影响。
       1  仪器与材料
       1.1   仪器 
       TCQ-250超声波清洗器；UV2000紫外－可见分光光度计；LD4-2低速离心机；TGL-16G台式高速离心机；旋转蒸发仪；JA12002电子天平。
       1. 2 药材 
       菟丝子药材购自北京同仁堂，经中国医学科学院药物研究所龚宁波鉴定为Cuscuta australis R. Br.的干燥成熟种子。
       1. 3  动物 
       昆明种雄性小鼠，体重（22. 0±2.3）g ，由中国医学科学院实验动物中心提供。
       1. 4 试剂 
       SOD测试盒和MDA测试盒均由南京建成生物工程研究所提供。葡萄糖(精制)、浓硫酸、苯酚(重蒸)均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  样品的前处理菟丝子药材用无水乙醇回流2次，残渣风干，保存备用。
       2.2 菟丝子多糖的提取流程菟丝子(超声水提取2次)→提取液(过滤)→滤液(浓缩)→浓缩液(醇沉)→沉淀复溶(除蛋白)→水溶液(醇沉)→菟丝子多糖粗品(洗涤，干燥)→菟丝子多糖
       2.3  多糖含量测定
       2.3.1  标准曲线的制作
       按文献制作标准曲线，精密称取葡萄糖(105℃干燥4 h)40 mg定容至100 ml，配成浓度为0.4 mg/ml的葡萄糖溶液，取上述溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 ml分别于10支试管中，加入蒸馏水至2ml，加入1ml5%苯酚溶液，摇匀后迅速加入5ml浓硫酸，摇匀后静置10min，置沸水浴中加热15 min，冷至室温，加水补至10 ml,于490  nm处测定A490，以0.0号管作空白，以A490作纵坐标，对应的糖含量作横坐标作标准曲线。标准曲线的回归方程为：A＝8.411 4C＋0.000 7，r＝0.999 6。
       2.3.2  超声提取菟丝子多糖条件的优化 
       在单因素考察的基础上，确定料液比，提取温度，提取时间作为考察因素，每个因素拟订3个水平。见表1。表1  实验因素水平（略）
       2.3.3   多糖的测定称取干燥后的菟丝子多糖30 mg，定容至50 ml，取1.0 ml加蒸馏水至2.0 ml，重复上述测定过程，记录吸光度值。
       2.4  药理实验
       2.4.1  动物分组及给药方式 
       将50只小鼠随机均分为正常组、对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只。正常组自然饲养，其余各组分别采用生理盐水、菟丝子多糖溶液(100，200，400 mg/kg)灌胃，然后让小鼠在桶中游泳，水温约为18℃，当小鼠的四肢不能划水，头将要沉入水中即可将其捞出，用吹风机将小鼠身上的毛吹干，每天上下午依法各操作1次，连续7 d，期间禁食不禁水。
       2.4.2  测定指标 
        
       将小鼠断头，取其大脑皮质,用生理盐水作为匀浆液，在冰浴中匀浆。取匀浆按试剂盒操作说明分别测定SOD和MDA。
       2.4.3  统计学处理
       所有数据均用(±s)表示，采用组间t检验，使用SPSS13.0处理实验数据。
       2.5  结果分析
       2.5.1  正交实验结果与分析 
       选用L9(34)正交表安排实验，测定多糖含量并作直观分析。结果见表2。表2   L9(34)正交实验结果与分析（略）
        由正交实验和极差分析可知，影响菟丝子多糖提取率的诸因素的主次关系依次为提取温度(B)，料液比(A)，提取时间(C)，最佳组合为A2B3C2。
       2.5.2  正交实验的方差分析结果为判断上述三类受控制的因素对实验结果的影响是否存在，将正交实验数据进行方差分析，找出其中起主导作用的差异来源。正交实验的方差分析结果(见表3)，温度的差异最显著(P<0.01)，料液比的差异显著(P<0.05)，时间差异不显著(P>0.05)，说明温度和料液比对菟丝子多糖提取率起主要作用，提取时间的作用贡献较小。表3  正交设计方差分析(略)
       2.5.3  验证实验称取菟丝子药材5份，选取正交设计分析的超声波提取最佳工艺条件，进行提取并检测菟丝子多糖含量，得到的平均提取率为6.13%(n=5)，由此验证了实验条件。
       2.5.4  回收率实验称取菟丝子药材5份，分别加入30 mg葡萄糖，按照最佳工艺条件进行提取并检测菟丝子多糖含量，计算菟丝子多糖的回收率为（99.36+1.87）%，RSD%为1.88。
       2.5.5  小鼠脑组织MDA和SOD含量测定  经实验测定，与对照组比较，高中低剂量的菟丝子多糖均能降低应激小鼠脂质过氧化水平，其中中高剂量组差异均有高度显著性(P<0.01)，结果见表4 。表4  菟丝子多糖对应激小鼠脑组织MDA及SOD的影响(略)
       3 讨论
        超声提取菟丝子多糖主要是利用了超声的空化作用，即一定频率的超声波作用于溶液时，液体中尺寸适宜的小气泡发生共振现象，强烈的冲击波使细胞壁破裂，有效成分溶出，且体系的温度不会大幅升高，有利于有效成分活性的保留。
        超声提取菟丝子多糖时，提取时间不宜过长，随着时间的增加，提取效率逐渐升高，但到达一定时间后，提取效率不升反降，究其原因，可能是由于超声波具有较强的机械剪切作用，长时间的作用会使大分子的多糖断裂，从而降低了多糖的收率。
        在综合考虑能耗高低、时间长短、提取方法的简繁、提取效率的高低等因素，超声提取方法明显优于加热回流法，其能耗低，提取时间短，操作方便，产率较高，生物活性易保留，是提取中药材菟丝子中多糖成分的一种有效的方法。
        MDA是重要的脂质过氧化反应产物之一，测定MDA的量常能反映机体内脂质过氧化反应的程度，间接反映出细胞损伤的程度。正常情况下，体内的氧化和抗氧化系统存在动态平衡，SOD对机体氧化和抗氧化系统平衡起着至关重要的作用，它能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。SOD活力的高低间接反映了机体清除自由基的能力。本实验通过耐力游泳造成应激动物模型，观察不同剂量的菟丝子多糖对应激状态下小鼠大脑皮质中的脂质过氧化MDA的含量及抗过氧化酶SOD的活性的影响，结果表明，不同剂量的菟丝子多糖均能降低应激小鼠大脑皮质中的脂质过氧化MDA的含量，并能增加抗过氧化酶SOD的活性，从而说明菟丝子多糖具有抗脂质过氧化，保护脑组织的作用。
       【参考文献】
         　　［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，1993：2006.
       
       ［2］叶敏，阎玉凝．菟丝子药理研究进展［J］.北京中医药大学学报，2000，23(5)：52.
       
       ［3］朱丽华，蒋国强，杨永新．高效液相色谱法测定菟丝子中芦丁、槲皮素及山萘酚的含量［J］.浙江中医学院学报，2001，25(4)：65.
       
       ［4］佘白蓉，秦达念，杨绮华，等．菟丝子黄酮与淫羊藿黄酮对雄性生殖功能影响的对比研究［J］.中华实用中西医杂志，2003，3(16)：842.
       
       ［5］王展，方积年．具有抗氧化活性的酸性菟丝子多糖H2的研究［J］.植物学报，2001，43(3)：243
       
       ［6］蔡曦光，葛斌，许爱霞，等．菟丝子多糖对衰老小鼠脂质过氧化的影响［J］.中国新药与临床杂志，2005，24(7)：521.