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       【摘要】 
       目的研究以丙酮为溶剂提取杜仲叶绿原酸的最佳工艺条件。方法通过单因素实验研究各因素对提取率的影响，应用正交实验优化工艺条件。结果丙酮提取杜仲叶绿原酸最佳工艺条件为：丙酮浓度40%，提取温度65℃，料液比1∶13，提取时间2 h，提取两次。结论在最佳条件下，绿原酸提取率和得率分别为2.25%，17.15%，纯度达到13.12%。
       【关键词】  绿原酸； 提取； 杜仲叶； 丙酮
       Study on the Extraction Technology of Chlorogenic Acid from the Leaf of Eucommia ulmoides
       LIU Junhai， REN Hui-lan,QIU Aiyong
       （1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Liaocheng   University,252059,China; 2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,214036,China)
       Abstract：ObjectiveThe extraction technology of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaf  was studied with acetone as solvent.  MethodsMain factors influencing the extraction of chlorogenic acid from the leaves of Eucommia ulmoides were studied by single factor experiments,and then the optimized conditions for the extraction of chlorogenic acid were studied by orthogonal test. ResultsOptimized conditions were obtained as follows: acetone concentration 40%;extraction temperature 65℃; material to solvent 1:13,extraction time 3 h ,and extraction twice. ConclusionThe extraction ratio of chlorogenic acid  and the yield of extract were 2.25%,17.15%,respectively,and the purity of chlorogenic acid was 13.12% in the optimized conditions.
       Key words：Chlorogenic acid；  Extraction；  Leaf of Eucommla Ulmoides；  Acetone
        绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物［1］。绿原酸是一种具有广泛生理活性和药理活性的物质，具有利胆、抗菌、降压、增加白血球及兴奋中枢神经系统、抗肿瘤、降脂、清除自由基等多种药理作用，对消化系统、血液系统和生殖系统疾病均有显著疗效［1～6］。因此，绿原酸在医药制剂上应用越来越广泛，是目前国际公认的“植物黄金”。绿原酸主要存在于杜仲、金银花、葵花籽粕、元宝枫等植物中［7，8］。近几年研究发现，杜仲叶Eucommia ulmoides leaves中含有较高的绿原酸，其叶中含量为1%～5.5% ［9，10］。杜仲是我国的特殊经济林，在我国栽培面积相当广泛，全国约有杜仲林28万ha，每年可产叶400万吨［11］，而杜仲叶的利用率仅占可采集叶的10%～20%。因此利用杜仲叶生产绿原酸具有巨大的社会效益和经济意义。
       
       在中草药有效成分提取过程中，常用乙醇为溶剂。我们在提取杜仲叶绿原酸研究中发现，乙醇提取虽然得率相对较高，但在提取过程中醇溶性蛋白质、黏液、树脂、鞣质、色素、油脂等杂质析出量大，过滤较困难，尤其是当溶剂中含水量高时更加明显，同时给以后的分离纯化工序造成很大困难。因此有必要寻找更好的提取剂提取。绿原酸属酚酸类化合物［12］，也属植物多酚类物质［13］。有资料报道［14］，丙酮和丙酮-水体系对植物多酚具有很强的溶解性，而且用丙酮提取杜仲叶中主要活性成分的工艺未见文献报道。本实验采用丙酮-水体系对杜仲叶中绿原酸提取工艺进行研究。
       1  器材与方法
       1.1  材料与仪器杜仲叶，购于北京某地区，为初秋采集叶。绿原酸标准品（中国药品和生物制品鉴定所）；丙酮、正丁醇、冰乙酸均为分析纯（上海试剂公司）；实验用水为去离子水。 Unic-2100型紫外可见光分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；365 nm紫外分析仪（上海科艺光学仪器厂）；SHZ-III循环水多用真空泵（上海亚荣生化仪器厂）。
       1.2  方法
       1.2.1  杜仲叶中绿原酸含量的测定采用纸层析-紫外分光光度法［15］。
       1.2.2  提取单因素实验随机称取5 g干燥的杜仲叶粉（20目），置于250 ml平底烧瓶中，采用不同的实验方法设计进行提取。改变提取条件以确定提取因素变化范围以及各因素的较佳值。每次提取液过滤，真空蒸发去除丙酮后，用去离子水定容至100 ml，测定绿原酸的含量，并折算为每100 g干叶中的提取得率。
       1.2.3  正交实验设计在提取单因素实验的基础上，采用正交实验优化工艺条件。以丙酮浓度、浸提温度、浸提时间、料液比4个因素作为考察对象，每个因素选用3个水平。选用L9（34）表，并安排实验，优化工艺条件。
       2  结果
       2.1  丙酮浓度对提取率的影响
       在提取温度35℃ ，料液比1∶12，提取时间2 h，丙酮浓度对绿原酸提取率的影响见图1。由图1可以看出，当浓度低于40%时，随着丙酮浓度的增加，绿原酸的提取率升高，用40%丙酮的提取，其提取率最高。随后，绿原酸的提取率随丙酮的浓度的升高而降低。
       2.2  温度对提取率的影响
       不同提取温度对绿原酸提取率的影响见图2。从图2可以看出，随着提取温度的升高，其提取率增加，当温度高于55℃时，不再增加。这是由于温度升高，分子运动加快， 有利于分子的扩散，有利于活性物质的溶出；当温度过高时，丙酮气化，不利于活性成分的析出，而且温度过高，杂质溶出量也相应增大，活性成分易分解破坏。
       2.3  料液比对提取率的影响
       不同料液比对绿原酸提取率的影响见图3。随着溶剂量的增加，浸提效果也随之增高，但提高幅度减小。当料液比超1∶12时，它们的提取率无明显变化。料液比过大给后续蒸发工序造成困难，且成本增大，因此，料液比采用1∶12左右为宜。
       2.4  提取时间对提取率的影响
       在提取液中，当植物材料细胞内外活性成分含量未达到平衡时，提取率随提取时间的延长而增加。一旦细胞内外浓度达到平衡，活性成分不再溶出。提取时间对绿原酸提取率的影响见图4。
        从图4可以看出，随着提取时间的增加，绿原酸的提取率不断提高，尤其是从1h延长到2 h时，绿原酸提取率提高幅度较大，提取时间在2 h和3 h之间绿原酸提取率基本保持稳定趋势。而提取时间在3 h以后绿原酸提取得率呈现出缓慢上升趋势。
       2.5  提取次数对提取率的影响
       在其它条件不变的情况下，提取次数对绿原酸提取率的影响见图5。从图5可以看出，提取次数多，绿原酸的提取率高。当提取次数超过两次时，提取率增加不明显。所以，提取次数以两次为好。
       2.6 pH值对提取效果的影响
       在固定料液比1∶12，提取温度35℃，提取时间2 h的情况下，用不同pH的40%丙酮提取，浸提剂pH对提取效果的影响见图6。
        从图6可以看出，对于绿原酸的提取，当pH值低于4时，随着pH值的增加提取率增加；当pH=4时，绿原酸的提取率达到最大；当pH值再增加时，提取率下降。绿原酸是极性有机酸，在酸性介质中比较稳定，因此，绿原酸的提取，宜在酸性溶剂中进行。但是，无论是碱性溶剂提取还是酸性溶剂提取，都会影响废水的排放处理，从产业化和环境保护考虑，其均不宜在酸性或碱性溶剂中提取，宜在中性水溶液中进行，因此，pH值对提取率的影响在以后的工艺条件优化中不做考虑。   
       2.7  丙酮-水溶液提取绿原酸工艺条件的优化从以上单因素可知，杜仲叶绿原酸在提取过程中，受到浸提时间、温度、丙酮浓度和丙酮溶液用量等因素的影响。为探索最佳提取条件，在单因素的基础上，对上述4个因素分别取3个水平，采用L9（34）正交实验设计进行优化，各因素和水平如表1。正交实验方案和结果见表2。各因素与绿原酸提取率的关系直观图见图7。表1  影响绿原酸提取率的因素及水平数（略）表2  绿原酸提取正交实验表L9（34）（略）
        对正交实验有关数据作极差分析，结果见表2。由表2可知，各因素对绿原酸提取率的影响程度依次为C＞A＞B＞C。在4个影响因素中，料液比、温度对提取率影响较大，其次是丙酮浓度，影响最小的是浸提时间。由图7表明，以绿原酸提取率为考察指标，依次最佳工艺条件是A3B2C2D3，各因素的最佳水平分别是：浸提温度65℃，浓度40%，料液比1∶12，浸提时间3 h。说明绿原酸提取率明显受到温度的影响，因为升高温度，增加分子的热运动，使溶剂和叶粉分子间的传递加速，有利于绿原酸的浸出。但绿原酸为热敏性物质，温度过高，会造成绿原酸的分解，并引起丙酮汽化挥发损失。因此温度控制在65℃以下。丙酮的浓度对提取率的影响次之，随着浓度增加，溶剂极性降低，同绿原酸的极性差拉大，不利于绿原酸的浸出。料液比的增大，溶剂与叶粉固体溶质间的浓度差增大，有利于传质，因此，绿原酸提取率增大。料液比增大，虽然有利于传质，但料液回收量增加影响成本。因此，料液比应控制在1∶12为最佳。浸提时间延长，有利于提取率的增加，但时间过长，绿原酸分解，反而降低绿原酸的含量，时间过短，也不利于绿原酸的浸提，应控制在3h以内为宜。
       在提取过程中发现，丙酮-水体系作浸提剂，其提取液中蛋白质、黏液含量减少，而糅质含量增加，蛋白质在丙酮中的溶解度较小，而丙酮-水体系为糅质的最佳溶剂［14］；提取液始终呈褐色，叶绿素等色素析出较少。因此，采用丙酮-水体系避免了醇溶性色素的大量析出，有利于绿原酸的分离和纯化。但缺点是丙酮溶液提取，其绿原酸提取率相对于水溶液提取和醇溶液提取低。
       2.8  最佳条件下的放大验证实验取100 g干燥粉碎的杜仲叶装入2 000 ml烧瓶中，在最佳提取条件下浸提，重复实验3次取平均值。结果见表3。表3  丙酮提取工艺验证实验结果（略）
       3  结论
        采用丙酮为溶剂提取绿原酸，避免了醇溶色素的溶出，提取物纯度高，但得率稍低。单因素实验和正交实验分析研究表明，提取杜仲叶绿原酸的最佳工艺条件：乙醇浓度40%，提取温度65℃；料液比1∶12，提取时间3 h，浸提两次。通过在最佳条件下的验证实验表明，绿原酸的提取率为2.25%，提取物得率17.25%，绿原酸含量13.12%。
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