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       【摘要】 
       目的建立RP-HPLC法测定马鞭草中乌索酸和齐墩果酸的含量。方法色谱柱为Nucleosil C18柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm），流动相为甲醇-水(88∶12, V/V)，流速为0.8 ml/min，检测波长为210 nm，柱温25℃。结果乌索酸在0.458～4.109 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 7)，平均回收率为98.1 %，RSD=1.1%；齐墩果酸在0.156～1.389 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 6)，平均回收率为101.7%，RSD=1.7%。结论方法快速简便、准确可靠，可作为马鞭草药材的质量控制方法。
       【关键词】  马鞭草；乌索酸；齐墩果酸；反相高效液相色谱法
       Determination of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in Verbena officinalis L. by RP-HPLC
       XIE Wanbin, ZOU Shengqin, CHEN Wu
       1.College of Chemistry and Bioengineering of Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000 , China;
       2.Key Laboratory of Jiangxi Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines, Yichun, 336000, China
       Abstract：ObjectiveTo establish a method for determining ursolic acid and oleanolic acid in Verbena officinalis L. by high performance liquid chromatography. MethodsThe separation was carried out on Nucleosil C18 column(4.6 mm×250 mm, 5 μm) with methanol-water (88∶12,V/V) as the mobile phase.The flow rate was 0.8 ml/min and the detection wavelength was 210nm. The column was used at 25℃. ResultsUrsolic acid showed a good linear relationship in the range of 0.458～4.109 μg (r=0.999 7) and the average recovery was 98.1%. RSD was 1.1%. Oleanolic acid showed a good linear relationship in the range of 0.156～1.389μg (r=0.999 6) and the average recovery was 101.7%. RSD was 1.7%. ConclusionThe method is rapid, simple, accurate and reliable and can be used for the quality control of Verbena officinalis L.．
       Key words：Verbena officinalis L.；Ursolic acid；Oleanolic acid；RP-HPLC
       
       马鞭草为马鞭草科植物马鞭草Verbena officinalis L.的干燥地上部分，又名铁马鞭、疟马鞭、土荆芥。马鞭草为传统中药，具有清热解毒、活血散淤、利水消肿等功效，可用于治疗疟疾、白喉、传染性肝炎、流行性感冒等［1］。马鞭草含马鞭草苷、5-羟基马鞭草苷、熊果酸、挥发油等多种化合物［2］。现代药理研究表明，乌索酸（熊果酸，Ursolic acid）具有抗肝炎、抗肿瘤、抗病毒、抗炎抑菌及增强免疫功能等多种药理活性，具有重要的药用开发价值［3］。本实验采用RP-HPLC法同时测定了马鞭草中乌索酸和齐墩果酸的含量，为控制药材质量提供科学依据。
       1  器材
       1.1  仪器
       Waters515双泵型高效液相色谱仪（2996光电二极管矩阵检测器，77251进样阀，20 μl定量环，Empower中文色谱工作站，美国Waters公司）；RO-MB-10D高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）；CP225D电子分析天平（德国Sartorius公司）；202-26A型数显电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；KS-1500超声提取仪器 (宁波科盛仪器厂)。
       1.2 材料
       马鞭草购于江西省宜春市药材市场，经江西省天然药物活性成分研究重点实验室鉴定为马鞭草科植物马鞭草Verbena officinalis L.的干燥地上部分。
        甲醇为色谱纯（上海陆忠试剂厂），水为高纯水，95%乙醇(分析纯，江西同盟试剂化工厂)，乌索酸和齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：110742-200516，110709-200511）。
       2  方法与结果
       2.1 色谱条件色谱柱为Nucleosil C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μl, 带保护柱)；流动相为甲醇-水（88∶12，V/V）；流速为0.8 ml/min；柱温为25 ℃；检测波长为210 nm；以《美国药典》方法计算，乌索酸和齐墩果酸理论塔板数均大于10 000。乌索酸和齐墩果酸对照品及马鞭草样品的HPLC色谱见图1。
       2.2  对照品溶液的配制精密称取干燥至恒重的乌索酸对照品 22.8 mg 和齐墩果酸对照品 7.8 mg ，置于 10 ml 容量瓶中，加入适量甲醇溶解，用甲醇定容，得对照品储备液。精密吸取1 ml混合液置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混合均匀，制成乌索酸和齐墩果酸的浓度分别为 0.228 μg/μl 和 0.078 μg/μl 对照品混合溶液，备用。
       2.3  样品溶液的制备将马鞭草样品置烘箱中 85℃ 烘干12 h，研细后精密称取约 4 g ，置于具塞三角烧瓶中，加入 10 倍量 95% 乙醇，采用超声法提取 60 min ，过滤，药渣洗涤两次，合并滤液于 50 ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。滤液用 0.2 μm 的滤膜过滤，得马鞭草提取物的样品溶液。
       2.4  线性关系实验分别精密吸取对照品的混合溶液2.0，6.0，10.0，14.0，18.0 μl进样分析，按选定的色谱条件进样并测定峰面积。以峰面积（μV·s）对进样量(μg)进行线性回归，乌索酸和齐墩果酸的回归线方程分别为：
       
       YUA=5.18×105X-4.36×104（r=0.999 7）
        YOLA=6.21×105X-6.32×104（r=0.999 6）
        表明当乌索酸进样量在0.458～4.109 μg，齐墩果酸进样量在0.156～1.389 μg范围内线性关系良好。
       2.5  精密度实验精密吸取对照品混合溶液10 μl，重复进样5次，分别测定峰面积值，计算出乌索酸的RSD为0.9%，齐墩果酸的RSD为0.7%，进样方法和仪器精密度良好。
       2.6   重复性实验取干燥至恒重的同一批马鞭草样品5份，按样品溶液制备方法制备样品溶液。精密吸取10 μl进样分析，乌索酸RSD为2.1%，齐墩果酸峰面积RSD为 2.3%。
       2.7  加样回收率实验精密称取干燥至恒重、已知乌索酸和齐墩果酸含量的马鞭草样品5份，每份约4g，加入适量乌索酸和齐墩果酸对照品适量，5份样品同时按样品溶液制备方法提取，进样分析。乌索酸平均回收率为98.1%，RSD 1.1%，齐墩果酸平均回收率为101.7%，RSD 1.7%。
       2.8  样品的含量测定精密吸取马鞭草样品溶液10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，外标法计算样品中乌索酸和齐墩果酸的含量。结果见表1。表1  马鞭草提取物中乌索酸和齐墩果酸含量（略）
       3  讨论
       3.1  提取方法从中草药中提取有效成分的常规方法主要有：热回流法、索氏法、煎煮法及渗滤法、冷热浸泡法等［4］ 。本文采用的超声提取法在提取过程中具有破坏植物药材细胞的作用，加速溶媒渗透到药材细胞中，使药材的化学成分易溶于溶媒中［5］。它与常规提取方法相比，具有提取时间短，产率高，降低溶剂消耗，节约能源的优点。
       3.2  提取时间样品加入10 倍量 95% 乙醇溶液，分别超声提取45，60，90，120，150 min，预处理后测定提取液中乌索酸含量，60min后乌索酸含量无明显变化，表明其成分提取完全，乌索酸平均加样回收率为98.1%，齐墩果酸的平均加样回收率为101.7%。
       3.3  检测波长取乌索酸和齐墩果酸对照品溶液进样，在190～500 nm波长范围进行光谱扫描，乌索酸和齐墩果酸在流动相中的最大紫外吸收波长均为204.5 nm（图2），但由于流动相在短波长处有末端吸收，为了消除背景，提高信噪比，提取不同波长的色谱图进行比较，选择210 nm为检测波长，信噪比高，峰形好，干扰小，最大限度地保证分析结果的准确。
       3.4  测定方法建立马鞭草中乌索酸含量的测定方法一般采用薄层色谱法［6］，但由于乌索酸和齐墩果酸极性相差极小，用薄层色谱法难以分离，其结果往往是两组分的总含量。采用高效液相色谱法能同时测定乌索酸和齐墩果酸的含量，两组分得到良好分离，具有简便，准确，灵敏度高，稳定性和重现性好的优点。
       【参考文献】
         　　［1］江苏新医学院.中药大辞典,上册［M］.上海: 上海科技出版社, 1979.
       
       ［2］国家医药管理局中草药情报中心站. 植物药有效成分手册［M］.北京:人民卫生出版社, 1986: 1101.
       
       ［3］陈武, 李开泉,熊筱娟,等.乌索酸的药理作用研究［J］.宜春学院学报,2003,25(4): 1.
       
       ［4］袁珂,李根林,李俊芝,等.车前草中熊果酸、齐墩果酸的HPLC测定［J］.中草药,1999,30(12):901.
       
       ［5］潘娓婕,李晓宁,张尊听,等.超声法从青风藤中提取青藤碱［J］.天然产物研究与开发,2003,15(2):127.
       
       ［6］陈在敏,袁 欣.薄层扫描法测定车前草中熊果酸的含量［J］.海峡药学,1998,10(2):47.