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       【摘要】 
       目的观察六味地黄汤生物制剂对实验肾阴虚小鼠脾T淋巴细胞亚群的影响，并与传统六味地黄汤进行比较。方法用甲状腺素和利血平建立肾阴虚小鼠模型，模型小鼠在服用药物1周后，称体重和计算脾脏指数，采用流式细胞仪测定脾脏T淋巴细胞亚群表达。结果六味地黄汤生物制剂对肾阴虚模型小鼠脾T淋巴细胞亚群CD4/ CD8比例有提高作用，与传统六味地黄汤组比较存在显著性差异（P<0.05）。结论六味地黄汤生物制剂对肾阴虚模型小鼠T淋巴细胞亚群具有显著的调节作用，可提高机体的细胞免疫功能，其作用优于传统的六味地黄汤。
       【关键词】  六味地黄汤生物制剂； 肾阴虚； T淋巴细胞亚群
       The Effect of Liuweidihuangtang Biological Preparation on T Cell Subsets in Kidney-Yin Deficiency Mice
       HU Xuguang，ZANG Jianwei，TANG Chunping ， YANG Chaoyan ， ZHAO Yue
       1.School of Chinese Medicine ,Guangdong Pharmacological University, 510006 China;
       2.The PHD Student, Guangzhou University of TCM, 510046, China;
       3.The MA Student , School of Chinese Medicine,Guangdong Parmacological University, 510006, China
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of Liuweidihuangtang Biological preparation (PSB) on T cell subsets in kidney-yin deficiency mice.MethodsNIH mice were orally given 150 mg/kg dosage of thyroxin , and 1mg/kg dosage of reserpine, once a day for continuing seven days. Five groups of mice were set up as PSB-LW group, LW group , PSB group, normal group and model group. The changes of body and spleen indexes were measured and the expression of CD4 and CD8 on T cell surface in spleen cells were detected by flow cytometry.ResultsLiuweidihuangtang biological preparation could increase the body weight and spleen index, raised the ratio of CD4/CD8 of T cell subsets in spleen.ConclusionLiuweidihuangtang biological preparation shows obvious immune regulation effect and is superior to the traditional Liuweidihuangtang.
       Key words：Liuweidihuangtang Biological preparation;   Kinney-yin Deficiency;   T cell subset
       
       六味地黄汤是祖国医学治疗肾阴虚的经典名方，由熟地、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓6味中药组成。现代药理学研究表明，该方具有增强免疫、抗衰老、调节内分泌、抗肿瘤等作用。光合细菌为厌氧光合菌纲，其营养成分丰富，具有增强抗病力，调节机体免疫活性等功能。本实验室首次采用光合细菌代谢六味地黄汤，制成新型的六味地黄汤生物制剂，并在临床实践中取得了满意的疗效。本课题前期研究表明，六味地黄汤生物制剂在治疗肾阴虚证、抗衰老、调节非特异免疫、特异性细胞免疫（Ｔ细胞产生迟发性变态反应）作用方面优于传统的六味地黄汤［1］。在此基础上研究六味地黄汤生物制剂对脾T淋巴细胞亚群的影响，并与传统六味地黄汤的作用相比较，为开发新中药生物制剂提供依据。
       1   材料与方法
       1.1   药物与试剂
       甲状腺素，德州生宝制药有限公司，批号060112；利血平，    广东邦民制药厂有限公司，批号061119； Rat anti mouse CD3-APC，Rat anti mouse CD4-FITC，Rat anti mouse CD8-PE， AbD serotec，批号20070123。
       1.2 六味地黄汤（LW）的制备熟地、山药、山茱萸、泽泻、丹皮、茯苓按处方的比例（8∶4∶4∶3∶3∶3）配药。加8倍量的水，文火煎煮1.5 h，滤过，药渣再加6倍量的水煎煮1.5 h，滤过。合并滤液，浓缩至0.5 g/ml，备用。
       1.3 六味地黄汤生物制剂的制备（PSB-LW）按上述方法制备的六味地黄汤经自然发酵后，按一定比例加入光合细菌，于光照培养箱中培养，6个月后即得。所制备的药液含生药材量同上，活菌数为1×109个/ml。
       1.4  动物NIH种小鼠，体质量(20±2)g，雌雄各半，由广东省实验动物中心提供（合格证号: 2006A017）。
       1.5  方法
       1.5.1 六味地黄汤生物制剂对肾阴虚小鼠体重、脾脏重量指数的影响将小鼠60只随机分为5组，每组12只，分别为空白对照组、模型组、六味地黄组、光合细菌组、六味地黄汤生物制剂组。除空白对照组外，其余各组动物灌胃给予甲状腺素150 mg/kg体重和利血平1 mg/kg体重，1次/d，连续7 d。与此同时，各组动物灌胃给予相应药物或对照物（见表1），1次/d，连续7 d。第8天处死动物称体重与脾脏的重量，并按照下列公式计算脾脏指数：脾脏指数＝脾脏湿重（g）/小鼠体重（g）。
       1.5.2 六味地黄汤生物制剂对脾T淋巴细胞亚群的影响在无菌条件下剖开小鼠腹腔取脾，称重，研磨过100目筛网，PBS液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2 000 r/min离心8 min ，弃上清液；加红细胞裂解液2 ml，混匀脾细胞，静止4～5min，待红细胞完全破碎，2 000 r/min离心8 min，弃上清液去除红细胞，PBS液洗2遍，用PBS重悬细胞，计数调整细胞浓度为106个/ml。加荧光抗体CD3-APC,CD4-FITC,CD8-PE各10 μl，暗处孵育30 min，用流式细胞仪计数CD3,CD4,CD8数目。
       2  结果
       2.1  六味地黄汤生物制剂对肾阴虚小鼠体重、脾脏重量的影响结果表明肾阴虚模型组动物体重、脾脏指数低于空白组；六味地黄汤及其生物制剂可以显著提高小鼠的体重与脾脏指数，且六味地黄汤生物制剂优于传统的六味地黄汤。结果见表1。表1 六味地黄汤生物制剂对肾阴虚小鼠体重、脾脏重量的影响（略）
       2.2  六味地黄汤生物制剂对脾T淋巴细胞亚群的影响结果表明肾阴虚模型组小鼠脾脏T淋巴细胞CD4/ CD8比值与空白组比较显著下降；经六味地黄汤及其生物制剂治疗后， T淋巴细胞CD4/ CD8比值显著提高且六味地黄汤生物制剂优于传统的六味地黄汤(P<0.05)。结果见表2。表2  六味地黄汤生物制剂对肾阴虚小鼠的CD4/ CD8的影响（略）
       3 讨论
        肾阴虚主要表现为机体多脏器的衰老、免疫功能低下及内分泌的紊乱［2］，肾阴虚小鼠免疫器官内的淋巴细胞凋亡,细胞数目减少［3］；脾脏体积缩小,重量减轻,免疫器官出现萎缩，六味地黄汤对肾阴虚引起的脾脏萎缩有拮抗作用，表明六味地黄汤对免疫具有明显的调节作用［4］。本次实验结果表明光合细菌代谢六味地黄汤能明显增加模型小鼠的体重及免疫器官脾的重量，且优于传统的六味地黄汤。
       
       脾T淋巴细胞具有多种生物功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促进丝裂原的应答反应以及产生淋巴因子等［5］，对体内一切体液和细胞免疫反应类型及强度都有重要的调节作用。在T淋巴细胞中，起主要作用的是CD4亚群和CD8亚群。CD4代表T辅助细胞，可诱导和辅助细胞毒性T细胞前身成熟为细胞毒T细胞并增强B细胞产生抗体， 调节免疫反应的活性；CD8代表T抑制细胞和T杀伤细胞，通过自身及抑制因子在免疫反应中起负向调节作用，抑制CD4细胞功能和B细胞功能，有免疫抑制和细胞毒性的作用［6～7］ 。CD4和CD8细胞在功能上相互诱导、相互制约形成Ｔ细胞网络，从而调节正常免疫功能和维持免疫的自稳性，一旦失去平衡，可以导致机体免疫功能紊乱而致病［8］。计数外周血和组织内淋巴细胞和其亚群的数目或比例以及所显示的功能强弱，以此判断机体的细胞免疫水平，对临床认识疾病，探讨其发病机制，观察病情，判断预后，考核疗效以及防治疾病等方面均有重要价值。T细胞亚群的比值CD4/CD8是反应T淋巴细胞活性的重要指标，其比值稳定；在正常范围内若比值增加，免疫增强，反之则减弱［9］ 。本次实验结果表明，肾阴虚小鼠脾T淋巴细胞亚群及其比例发生了变化，显著下降，光合细菌代谢六味地黄汤能明显提高脾T淋巴细胞亚群CD4/ CD8比例，其作用优于传统的六味地黄汤。
       
       光合细菌（Photosynthesisbacteria，PSB）是水圈微生物的一种，属原核生物界薄壁菌门中的厌氧光合菌纲，能充分利用光能和低级有机物为其营养源在厌氧条件下进行不放氧光合作用生长和繁殖光合细菌、利用有机物中的碳，同化其它营养进行生长繁殖，是高营养、高效能、多用途的有益微生物。国内外的研究报道光合细菌具有抗辐射、调节机体免疫活性 ［10，11］。清除自由基、调节免疫、抑瘤的作用［12］。
       
       本实验结果表明光合细菌代谢六味地黄汤可以提高肾阴虚模型组动物脾脏指数，提高CD4/ CD8比例，并优于传统的六味地黄汤。该结果提示六味地黄汤生物制剂调节T淋巴细胞亚群比例的平衡可能是其发挥 “滋补肾阴”作用的药理学基础。对于光合细菌代谢六味地黄汤调节脾T淋巴细胞作用机制有待进一步研究。
       【参考文献】
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