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       【摘要】 
       目的探讨小叶榕叶提取物中总黄酮的测定方法及其对羟自由基的清除能力。方法采用改进的铝盐显色分光光度法，在500nm 波长下，NaNO2-AlCl3-NaOH 为显色剂，常温显色。结果20 min内测定了小叶榕叶提取物中总黄酮的含量，回归方程为A=0.013 6C-0.003 1，RSD=1.44%，相关系数为0.999 7，加标回收率达到98.86%。结论该测定方法准确、可靠，结果令人满意；提取液总黄酮含量的增加，对羟自由基的清除能力也增强。
       【关键词】  小叶榕；鉴别；羟自由基; 紫外分光光度法
       Extraction and Distinction of Total Flavanone from Ficus microcarpa L. f. and its Effect on Scavenging of Hydroxyl Radicals
       LIU Liheng，WANG Lisheng， WANG Tianwen, LIU Xiongmin，YANG Xiaoqing
       (1.College of Chemistry and Chemical Engineering ，Guangxi University ,Nanning 530004 ,China； 2.Department of Chemistry and Biology, Yulin Normal College ,Yulin 537000 , China)
       Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination of total flavonone from Ficusmver carpalf and study its scavenging activity on hydroxyl radicals.MethodsThe flavonoids in Ficus m icroearpa L. f. were determined by ultraviolet spectrophotometry at 500nm.ResultsThe correlation coefficient of the stand curve was 0.9997 and the relative standard deviation was 1.44%.Beer"s law was obeyed in the range of 40～360μg·ml-1. The average recovery rate was 98.86%.ConclusionThe method is simple, accurate and reliable; the total flavonoids have scavenging capacity on hydroxyl radicals in a dependent manner.
       Key words:Ficus microcarpa L. f.;   Distinction;  Hydroxyl radicals;   UV Spectrophtometry
        小叶榕叶为桑科植物榕树Ficus microcarpa L. f . 的叶，异名落地金钱(《本草求原》) 。全世界榕树有八百多种，主要分布在热带亚热带地区。我国榕属植物约100种，属热带雨林的关键种类，主要分布在福建、广东、广西、海南、浙江和中国台湾等地区，为当地的主要植物品种之一。入药主用其叶Folium Fici Microcarpae 。有研究表明［1～8］小叶榕叶中主要含黄酮、三萜类、齐墩果酸、脂肪族化合物和甾体化合物等。其中黄酮类和内酯类等有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抗炎、抑菌、抗癌等方面有显著效果,无毒副作用，并以此开发出多种药品和保健食品［9，10］。
        黄酮类( flavontes)化合物是植物光合作用产生的一大类化合物，已知的此类化合物约有二千多种，有以黄酮( 22苯基色酮)为母核的一类黄色色素和黄酮的同分异构体及其还原产物，还包括黄酮醇类、异黄酮类、儿茶素类、双黄酮类及其衍生物。目前对银杏类黄酮的研究较多，但对于榕树黄酮类化合物的研究还相对比较缺乏。广西是我国小叶榕产量最大的省份之一，而对于它的利用存在着深加工产品少、生产技术落后和资源不能合理利用等缺点。目前我国对小叶榕的利用只是处于起步阶段，还未真正找到合理有效的利用途径。虽然用小叶榕浸膏作为主成分的哮喘和慢性支气管炎治疗药咳特灵胶囊已收载在部颁标准中，但小叶榕浸膏质量标准中没有详细的质量控制方法，仅仅是检查其水不溶物和测定其浸出物，这样的质量标准不能准确地反应其量效关系，究其主要的原因，是没有对其成分及其药理活性进行深入地研究。
        目前天然药用植物中黄酮类化合物测定方法主要有紫外可见分光光度法［11］、高效液相色谱法［12］、薄层色谱法等［13～15］。为此，本文采用改进的铝盐显色分光光度法测定了小叶榕叶醇提取物中总黄酮的含量并对其进行了鉴别，并就该提取液对Fenton 体系产生的羟自由基的清除作用进行了研究。
       1  器材
        自然干燥的小叶榕树叶、无水乙醇(AR)  ，2550紫外可见分光光度计(日本岛津)，芦丁对照品(中国药品生物制品检定所) 。RE-2000 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHB-Ⅲ循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。
       2  方法与结果
       2.1  小叶榕叶总黄酮成分提取研究小叶榕叶中黄酮类化合物提取方法时，一般采用溶剂直接提取后浓缩。而笔者在实验过程中发现，小叶榕叶中所含的脂溶性色素等物质会使显色法测定总黄酮时产生浑浊现象，造成很大误差。因此，本实验采用石油醚脱脂，冷却静置后过滤除去叶绿素后再测定总黄酮的工艺。准确称取落地金钱干燥品200 g，70% 乙醇回流提取，过滤，回收乙醇，蒸至约100 ml，用100 ml石油醚萃取3次，萃取液低温冷却静置48 h，过滤沉淀，萃取液蒸干得到粗提物。
       2.2  总黄酮的测定
       2.2.1  测定方法依据以芦丁为对照品测定榕树叶中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。
       2.2.2  对照品溶液制备精密称取芦丁对照品0.008 0 g , 60%乙醇定容至200 ml，制成40 μg·ml-1 贮备液备用。
       2.2.3  供试品溶液制备将各正交实验所得提取液合并，回收滤液，每个样品液中取0.5 ml加显色剂60%乙醇定容至25 ml量瓶中，精密移取0.5 ml定容至10 ml量瓶中备用。
       2.2.4  最大吸收波长的选择芦丁标样显色后扫描曲线如图1所示；小叶榕黄酮提取物显色后扫描曲线如图2所示。小叶榕黄酮提取物显色后扫描曲线和芦丁标样显色后扫描曲线峰形相似，在500 nm 处吸收最大，且峰形对称，故选择K= 500 nm 为测定波长。
       2.2.5  标准曲线的制备分别精密移取芦丁对照品储备液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 ml，于25 ml溶量瓶中，入0. 50 mol·L-1NaNO2 溶液1.00 ml，摇匀，5 min 后，加入0. 30 mol·L-1AlCl3 溶液1.00 ml ，摇匀，加入1.00 mol·L-1NaOH 溶液5. 00 ml， 60% 乙醇水溶液定容至刻度，配制成系列芦丁乙醇标准溶液。以芦丁做参比，用1cm比色皿在波长500 nm 处测其吸光度。以 吸光度值为纵坐标，质量浓度为横坐标进行回归，得方程A=0.013 6C-0.003 1，相关系数为0.999 7 如图3。
       2.2.6  线性范围的确定在相同体积下不同浓度的芦丁标准液在显色稀释后测定其吸光度见表1。从表1的数据可知当显色液中芦丁乙醇标准浓度超过360 μg·ml-1时, 再增加芦丁浓度，显色液的吸光度几乎无变化，故本方法选用较佳的线性范围是显色液中芦丁标准浓度在40～360 μg·ml-1 之间。表1  芦丁显色液的测定数据（略）
       2. 2.7  显色液的稳定性本实验对经铝盐显色后的提取液进行了稳定性的实验,结果如图4：显色后显色液在20 min 内相对稳定，20 min 后显色液吸光度开始下降，在空气中，且强碱性条件下，黄酮类化合物很易被氧化, 随时间延长吸光度下降，虽然从下降的绝对数值而言并不是很大，但相对的变化率已不可忽略，故最佳测定时间应该显色后20 min 内完成。
       2.2.8  回收率实验准确移取配制的地钱黄酮提取物待测溶液1.00 ml,7份，加对照品40μg·ml-1芦丁乙醇标准溶液1. 00 ml， 按“2.2.5”项下的方法操作，测定总黄酮含量，计算加标回收率。结果见表2。从表2可以看出，总黄酮的平均回收率达到98.86%，说明所采用的测定方法是可行的。表2  回收率实验（略）
       2.3  总黄酮的鉴别［16］
       2.3.1  三氯化铝反应取样品溶液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈淡黄色，在紫外光下有明显黄色荧光斑点。
       2.3.2  乙酸镁反应取样品溶液点在滤纸上，滴加1%乙酸镁甲醇溶液，加热干燥，紫外光下呈黄褐色斑点。
       2.3.3  盐酸一锌粉反应取乙醇提取液1 ml于试管中加入少许锌粉振摇，加入几滴浓盐酸 (1次加入)，微热，1min 后即呈紫红色。
       2.4  小叶榕树叶总黄酮提取物对羟自由基清除作用黄酮类化合物(Flavonoids)是多酚类物质，是许多中草药的有效成分。黄酮化合物由于结构上的特点，是一类天然的抗氧化活性的物质［17，18］，对超氧阴离子自由基(O-2·)、羟自由基(·OH)和单线态氧(1O2)有良好的清除作用。羟自由基(·OH)非常活泼，在含氧自由基中其氧化活性最强。但·OH存在时间短，除了电子自旋共振法(ESR)外，一般难于直接测定，故常用间接法测定［19，20］。最常用的间接测定方法是利用Fenton反应产生羟自由基［21］：
        H2O2+ Fe2+ → OH· + OH- + Fe3+
        OH·具有很高的反应活性，存活时间短。但在反应体系中加入水杨酸，能有效地捕捉OH·并产生有色产物。
        该产物在510 nm处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除羟自由基功能的被测物，便会与水杨酸竞争羟自由基，从而使有色产物生成量减少。采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系中，液)中加入一系列不同浓度的小叶榕榕树叶总黄酮提取液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液比较。在510 nm处测量含被测物反应液的吸光度,并与空白液比较,便能测定被测物对OH·的清除作用。其清除率计算式为：
        清除率（%）=100（A0-Ax）/A0×100%
       
       以实验的提取液总黄酮作为样品，分别取不同体积的样品定容到25 ml，分别测其对羟自由基的清除作用，结果见图5，可看出，小叶榕榕树叶总黄酮提取液对由Fenton产生的体系产生的羟自由基有很好的清除作用，随着小叶榕榕树叶提取液总黄酮含量的增加，对羟自由基自由基的清除能力也逐渐增强。
       3  结论
       实验结果表明,本实验所采用的测定小叶榕榕树叶总黄酮的铝盐显色分光光度法，方法准确，可靠；小叶榕榕树叶中含有较为丰富的黄酮类化合物，其提取物总黄酮对羟自由基具有很好的清除作用。
         
       小叶榕在我国南方地区有极其丰富的资源，入药主用其叶，然而，到现今为止，国内还没有任何有关小叶榕的单体化合物的研究报道。国外报道［1］从小叶榕中叶子中仅仅只是提取分离了6个萜类化合物，因此，小叶榕榕树叶具有广泛的开发前景和利用价值。深入系统研究小叶的化学成分和药理活性并建立准确的质量标准是一项迫切的任务。同时也将会为天然资源调查及小叶榕的进一步开发利用提供科学依据。
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