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       【摘要】 
       目的研究延龄草乙醇提取物、醋酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物抗炎、镇痛和凝血作用，筛选其活性部位。方法采用角叉菜胶致大鼠足跖肿胀模型和检测NO含量评价延龄草乙醇提取物的抗炎活性；用扭体法观察延龄草乙醇提取物的镇痛作用；采用玻片法、毛细管法测凝血时间研究延龄草乙醇提取物的凝血作用。结果通过测定大鼠体内NO含量，延龄草乙醇提取物有抗炎活性，与模型组相比有显著性差异；延龄草乙醇提取物、醋酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀均有显著的抑制作用，其中正丁醇萃取物比醋酸乙酯萃取物的作用更显著；对醋酸致痛有明显的镇痛作用，同时延龄草乙醇提取物有显著的促凝血作用。结论 延龄草乙醇提取物、醋酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物有显著的抗炎、镇痛和促凝血作用。
       【关键词】  延龄草； 抗炎； 镇痛； 凝血
       Study on the Anti-inflammatory, Analgesic and Thrombosis Effects of Extract of Trillium tschonoskii Maxim.
       YU Lingling，ZOU Kun,  WANG Junzhi，ZHU Liebin,ZHOU Yuan,YANG Jin
       (Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, College of Chemistry and Life Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002，China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the anti-inflammatory, analgesic and thrombisis effects of ethanol extracts, ethyl acetate extracts and n-butanol extracts of Trillium tschonoskii Maxim. MethodsThe rat hind paw swelling elicited by injection of carrageenan and measurement of NO concentration were used to evaluate anti-inflammatory activities; Analgesic effects were evaluated by torsion body method; expandedass and capillary tube methods were used to detect cruor activity.  ResultsThe extract could decrease the concentration of NO , which was significantly different between control group and model groups; ethanol extracts ,ethyl acetate extracts and n-butanol extracts of Trillium tschonoskii Maxim. significantly suppressed the edema of rat hind paw swelling elicited by injection carrageenan, and the effect of n-butanol extracts was more significant than that of the ethanol extracts of Trillium tschonoskii Maxim. The extracts could decrease the body torsion times of mouse and promote thrombosis.  ConclusionThe ethanol extracts of Trillium tschonoskii Maxim. have marked anti-inflammatory, analgesic and thrombosis effects.
       Key words：Trillium tschonoskii Maxim ;  Anti-inflammatory;  Analgesic;   Thrombosis
        延龄草Trillium tschonoskii Maxim.为百合科延龄草属植物，别名头顶一颗珠、芋儿七等。主产于西藏、云南、四川、陕西、甘肃、湖北、河南、安徽、浙江、福建等省，生于海拔1 000～3 200 m阴湿处， 湖北省主产于神农架林区和恩施州巴东县，是神农架著名的四大药材之一。味甘，性平，有小毒，是传统的名贵中药，有延年益寿的功效。主治头晕目眩、失眠、跌打损伤、外伤出血、神经衰弱、高血压病、脑震荡后遗症等疾病［1］，是恩施土家族著名民间药之一。
        从国内外的文献报道来看，目前对延龄草的药理活性研究仅仅限于其抗炎、抗衰老和免疫作用。肖本见等［2］对延龄草Trillium tschonoskii Maxim根茎的水提取物和乙醇提取物做了抗炎活性研究，发现其具有抗炎和提高免疫的作用，而且醇提物的抗炎作用比水提物强；黄丽亚等［3，4］研究了延龄草Trillium tschonoskii Maxim水提醇沉淀法所得的注射液，发现其有增强抗氧化酶表达作用。本实验对延龄草体乙醇提取物的抗炎、镇痛和凝血作用进行了研究，同时对各个萃取物进行活性筛选，为寻找活性成分提供了线索，也为开发传统中药提供科学依据，使丰富的植物资源得到有效利用。
       1  材料
       1.1  药材延龄草采于200509采自湖北省西部神农架林区，经三峡大学生物技术研究中心陈发菊副教授鉴定为延龄草Trillium tschonoskii Maxim.，其标本保存于天然产物研究与利用湖北省重点实验室标本室（编号TT200509SNJ）。
       1.2  仪器与试剂多功能提取罐（温州鸿驰化工医药设备有限公司）；LABCONCO 低温冷冻干燥仪（美国）；旋转蒸发仪（EYELA）；SHB-BA95型循环水式多用真空泵（中国河南省巩义市英峪予华仪器厂）；酶联免疫检测仪(GENIOS TECAN)；CO2培养箱（日本三洋公司）；LD4-2A离心机(北京医用离心机厂)；96孔板(美国Cornning公司)；甲醇，石油醚、醋酸乙酯、正丁醇均为分析纯（天津市天茂化学仪器供应站）；二氧化碳培养箱（SHEL LAB），XDS-1B倒置显微镜，胰蛋白酶 （华美生物工程公司）RPIM Medium 1640　(Invitrogen Corporation) 阿司匹林（武汉远大制药），三七、地塞米松(河南前锋药业)，冰醋酸（河南中促实业），角叉菜胶（Sigma产品）；新生小牛血清（杭州四季青生物材料有限公司）；胰蛋白酶（美国GIBCO公司）；四氮唑蓝(MTT)（美国AMRESCO公司）；丝裂霉素 (MMC，浙江海正药液股份有限公司)；DMSO(天津广成化学试剂公司)，NO试剂盒（南京建成）。
       1.3  动物SD大鼠、昆明雄性小鼠，体重18～22 g，由三峡大学实验动物中心提供。
       1.4  统计软件实验数据以±s表示，采用SPSS10.0进行方差分析。
       2  方法
       2.1  延龄草乙醇提取物及各萃取物的制备取延龄草地珠（6.4 kg）于48℃恒温烘箱中干燥，用中药粉碎机粉碎后过60目筛，用95%乙醇浸泡数小时后，利用多用强制渗漉罐提取，反复多次，减压浓缩提取液，冷冻干燥，得到延龄草乙醇提取物(2.4 kg)。取适量延龄草乙醇提取物，加适量水溶解，依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩，冷冻干燥，得到醋酸乙酯萃取物（525 g）和正丁醇萃取物（775 g）。
       2.2 抗炎活性
       2.2.1 延龄草提取物对巨噬细胞释放NO的影响［5］取大鼠24只，随机分成4组，每组6只。大鼠腹腔注射1%可溶性淀粉溶液和CMC-Na各5 ml。连续注射2 d后断头处死，用75%的酒精浸泡20 min，打开腹腔，用10 ml　PBS液无菌条件下洗出腹腔细胞，2 000 r·min-1离心10 min。作细胞计数，调整细胞浓度至106 cell· ml-1接种于96孔板中，每孔200 μl。放入CO2培养箱（37℃，5% CO2）内培养1h，加入刺激剂LPS（其终浓度为1 μg· ml-1），培养2 h，加底物花生四烯酸（AA）（其终浓度为3.15 μg·ml-1）和药物（乙醇提取物250 μg·ml-1），继续培养2 h。用微型旋涡混合仪振荡，培养液于1200 r· min-1离心15 min 。取上清100 μl于NO试剂盒，测在550 nm波长吸光值。
       2.2.2  延龄草提取物对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀炎症的影响［6,7］取56只小鼠，随机分成7组，分为空白组、模型组、阿司匹林组、乙醇提取物低剂量组、乙醇提取物高剂量组、正丁醇萃取物组、醋酸乙酯萃取物组。给药组分别ig延龄草乙醇提取物（0.256，1.024 g·kg-1）、正丁醇萃取物（0.164 g·kg-1）、醋酸乙酯萃取物（0.111 g·kg-1），阳性对照组ig阿司匹林（4.00 g·kg-1），阴性对照组ig等量的生理盐水，30 min后将0.5%角叉菜胶溶液0.1 ml注入右后肢脚掌皮下。空白组ig等量的蒸馏水。记录致炎前后不同时间右后肢踝关节以下容积，按下式计算其肿胀率和抑制率。
        肿胀率(%) = 致炎前后足跖容量之差/致炎前的足跖容积×100%
        抑制率（%）=（1－给药组平均肿胀率/模型组平均肿胀率）×100%
       2.3 镇痛作用［7］取48只小鼠，随机分成6组，分为模型组、阿司匹林组、乙醇低剂量组、乙醇高剂量组、正丁醇萃取物组、醋酸乙酯萃取物组。给药组分别ig延龄草乙醇提取物（0.256，1.024 g·kg-1）、正丁醇萃取物（0.164 g·kg-1）、醋酸乙酯萃取物（0.111 g·kg-1），阳性对照组ig阿司匹林（4.00 g·kg-1），阴性对照组ig等量的生理盐水，然后在小鼠腰部皮下注射8%冰醋酸溶液0.2 ml，开始记时，记录小鼠第1次做扭体动作的时间及在注射冰醋酸后10 min内扭体的次数，按下式计算其镇痛抑制率。
       
       抑制率（%）=（1-给药组扭体反应次数/模型组扭体反应次数）×100%
       2.4 凝血作用［8］取48只小鼠，平均分成6组，分为模型组、三七片组、乙醇低剂量组、乙醇高剂量组、正丁醇萃取物组、醋酸乙酯萃取物组。给药组分别ig延龄草乙醇提取物（0.256，1.024 g·kg-1）、正丁醇萃取物（0.164 g·kg-1）、醋酸乙酯萃取物（0.111 g·kg-1），阳性对照组ig三七片（1.5片·kg-1），阴性对照组ig等量的生理盐水，按号取小鼠尾部出血各2滴，一滴在玻片上，另一滴用毛细管吸取，开始记时，用细针挑玻片上血液和折断毛细管，分别记录出现血丝的时间，按下式计算其凝血率。
       
       凝血率（%）=空白组与给药组平均凝血时间之差/空白组平均凝血时间×100%　
       3  结果
       3.1  延龄草提取物的抗炎活性
       3.1.1  延龄草提取物对巨噬细胞释放NO的影响
       脂多糖（LPS）能刺激巨噬细胞释放NO，NO化学性质活泼，在体内代谢很快转为NO2-和NO3-，而NO2-又进一步转化为NO3-，利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-，能过显色深浅测定其浓度的高低，根据NO的浓度评价药物的抗炎活性。实验结果显示延龄草乙醇提取物在250 μg·ml-1能抑制巨噬细胞释放NO，与模型组相比有显著性差异（P<0.01）, 有明显的抗炎活性，结果见表1。表1   延龄草提取物对巨噬细胞释放NO的影响(略)
       3.1.2  延龄草提取物对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响 
       延龄草乙醇提取物和正丁醇萃取物有明显的抑制角叉菜胶致小鼠足跖肿胀作用，其中正丁醇萃取物作用更明显，延龄草乙醇提取物在1.024 g·kg-1时抗炎抑制率可达73.97%，正丁醇萃取物在0.164 g·kg-1时抗炎抑制率达67.90%，醋酸乙酯的抗炎作用不明显。结果见表2。表2  延龄草提取物对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响(略)
       3.2  延龄草提取物的镇痛作用
       延龄草提取物对小鼠扭体法致痛实验表明，延龄草乙醇提物、正丁醇萃取物和醋酸乙酯萃取物均有显著的镇痛作用，作用发挥迅速明显，与模型组均有显著性差异。其中正丁醇萃取物的作用最明显，在0.164 g·kg-1的镇痛作用可达到60.49%。结果见表3。表3   延龄草提取物对小鼠扭体法致痛实验的影响(略)
       3.3  延龄草提取物的凝血作用
       延龄草乙醇提物、正丁醇萃取物和醋酸乙酯萃取物均有明显的促凝血作用，其中醋酸乙酯萃取物的效果最为明显。结果见表4。表4   延龄草提取物对小鼠凝血时间的影响(略)
       4  讨论
        延龄草作为神农架林区的珍贵药材，在民间享有极高的声誉。尽管延龄草民间应用疗效确切，国内外学者对其药理活性和化学成分也进行了初步研究，但是目前我们仍然很难依据现有研究资料对其进行合理开发和利用。
        以上研究表明，延龄草乙醇提取物体、醋酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物具有良好的抗炎、镇痛和促凝血作用，其中正丁醇萃取物的作用更显著，可能为其药理活性的有效部位，但是其有效成分及其构效关系还有待进一步深入研究。
       【参考文献】
         　　［1］《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编，上册，第2版［M］.北京：人民卫生出版社，1998：225，226.
       
       ［2］肖本见，陈国栋，谭志鑫，等. 头顶一棵珠抗炎和免疫作用的实验研究［J］.安徽医药，2005，246.
       
       ［3］黄丽亚，张晓红. 延龄草注射液上调抗氧化酶表达作用的实验研究［J］.湖北中医杂志 , 2006,28(9):7.
       
       ［4］许沛虎.头顶一棵珠内科临证举隅［J］.时珍国药研究，1994,5（4）：9.
       
       ［5］贾景明，吴春福. 天山雪莲培养物含药血清对大鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮释放的影响［J］.药物研究，2006，15（18）：16.
       
       ［6］H. Gerhard Vogel .杜冠华译.药理学实验指南——新药发现和药理学评价［M］.北京：科学技术出版社，2001：535，536，544，583.
       
       ［7］徐叔云，卞如濂，陈 修，等.药理实验方法，第1版［M］.北京：人民卫生出版社，1982：934，945,911.
       
       ［8］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1982：484.