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       【摘要】 
       目的研究银杏达莫对兔心肌缺血再灌注损伤内皮细胞的保护作用。方法结扎兔左冠状动脉前降支制作心肌缺血再灌注损伤模型。实验兔随机分为空白对照组（假手术）、缺血再灌注组和银杏达莫组。银杏达莫组在心肌缺血前10min给予银杏达莫。观察各组缺血再灌注过程中心电图的动态改变，以及银杏达莫对血管性血友病因子及丙二醛和血清一氧化氮含量的影响。结果缺血再灌注组和银杏达莫组均造成明显的心电图动态改变，与空白对照组比较，银杏达莫组心电图ST段出现有效改变。银杏达莫组与缺血再灌注组比较血管性血友病因子活性和丙二醛水平较缺血再灌注组显著降低，而血清一氧化氮水平明显提高。结论 银杏达莫对心肌缺血再灌注损伤内皮细胞有明显的保护作用，其作用与清除氧自由基的膜脂质过氧化及扩张冠脉有关。
       【关键词】  银杏达莫； 心肌缺血再灌注损伤； 内皮细胞； 心肌保护； 脂质过氧化
       The Effects and Mechanism of Extract of Ginkgo Biloba on Endothelial Cells Injury Induced by Myocardial Ischemia-reperfusion in Rabbits
       GUO Xiao ,  WANG Li , LU Yan,GAO Yan
       （Lanxi Hospital of Lanzhou City, Lanzhou, 730050, China）
       Abstract：Objective To study the protective effects and mechanism of Egb on endothelial cell injury induced by myocardium experienced ischemia-reperfusion in rabbits. MethodsThe model of myocardial ischemia-reperfusion injury was established by ligating the left anterior descending artery of New Zealand rabbits. Anesthetized rabbits were randomly divided into 3 groups: blank control group (n=9) in which left anterior descending coronary artery was exposed and a piece of silk thread was placed around the artery but not tied; Myocardial ischemia-reperfusion group (n=9) in which 1ml/kg normal saline was injected into vein 10 min before logation. Egb group (n=9) received intravenous inject on of Egb 10min before logation. The effect of egb on the von willebrand factor (vWF), malondialdehyde (MDA) in the plasma, the level of serum NO in injured rabbits and ECG were observed. ResultsCompared with blank control group or myocardial ischemia-reperfusion group, Egb group showed protection against injury as evidenced by more effective improvement in ST of ECG. Egb could evidently decrease the contects of MDA and vWF and increase serum NO as compared with ischemia-reperfusion group. ConclusionEgb has a protective effect on endordnelial injury induced by myocardial ischemia-reperfusion throngh inhibiting lipid peroxidation and increasing NO preduction.
       Key words：Egb;   Myocardial ischemia-reperfusion;  Endothelial cells;  Myocardial protection;   Lipid peroxidation
       
       冠状动脉粥样硬化所致心肌缺血病变是一种“代谢性疾病”。一些研究显示冠心病梗塞心肌相关血管再开通后，部分患者反而会因发生急性血流动力学障碍而死亡，称为心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)［1］。MIRI与心肌细胞密切相关，血管内皮细胞是MIRI时氧自由基，黏附因子和其他生物活性物质的来源，所以早期血管内皮细胞的结构和功能严重损伤又是构成MIRI的病理生理学基础。银杏提取物（Extract of ginkgo biloba, EGB）具有改善血液流变状态、抑制血小板聚集、抗氧化、清除自由基、缓解缺血、缺氧和舒张血管平滑肌等药理作用［2,3］，并且可以缩小急性心肌梗塞范围及减轻梗塞程度［4,5］。所以推断银杏达莫对心肌内皮有部分保护作用。本研究对在体兔心肌缺血再灌注诱导内皮细胞损伤模型予银杏达莫干预，初步探讨其对损伤的心肌内皮细胞的保护作用。
       1  材料与方法
       1.1  药物和试剂 
       银杏达莫，由山西普德药业公司提供（批号： 国药准字H14023515）。丙二醛（Malondialdehyde, MDA） 、一氧化氮（NO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所， 血管性血友病因子（Von willebrand factor ,vWF）试剂盒购自上海朗卡公司。
       1.2  动物 
       健康新西兰大白兔，雌雄不限，共27只，体重（2.82±0.31）kg，由兰州生物制品研究所提供。
       1.3  模型制备动物分组
       1.3.1  心肌缺血再灌注损伤模型［6］及标本的采样 
       选择健康新西兰大白兔,20%乌拉坦按5 ml/kg耳缘静脉麻醉，气管插管，人工呼吸，开胸，暴露心肌，自冠状动脉左前降支(Left anterior descending coronary artery, LAD)0.5 cm处穿线环绕动脉，结扎线线自一胶管腔内引出，结扎LAD，造成急性心肌缺血,通过肉眼观察及心电图改变判断LAD结扎是否成功。LAD结扎30 min后剪开穿线使冠状动脉再通形成再灌注，再灌注30 min，从左心室取2 ml制备血浆供检测。入选标准：结扎后Ⅱ导联ST段出现弓背向上抬高，T波高耸等表现为缺血成功。剪线后，行再灌注，抬高的ST段出现下降1/2以上为再灌注成功，行再灌注60 min。
       1.3.2  分组与给药  
       大白兔随机分为3组，每组9只。空白对照组（Ⅰ组）行假手术(Sham operated control，SC)，即在LAD0.5 cm处穿一胶管内引丝线，但不予结扎；缺血再灌注组（Ⅱ组）和银杏达莫组（Ⅲ组，缺血再灌注+银杏达莫）于结扎前10 min，Ⅱ组静注生理盐水1 ml/kg，Ⅲ组静注银杏达莫30 ml(银杏总黄酮10 mg/kg，双嘧达莫8 mg/kg)。
       1.4  心电图动态变化记录  
       全程记录心电图变化,心电图显效标准为缺血导致抬高的ST段在再灌注60 min内恢复接近正常基线。
       1.5 检测指标 
       采用硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid, TBA）法测定血浆MDA含量（nmol/ml）；血浆vWF活性由ELISH法测定其百分率；取已分离血清1 ml,由化学比色硝酸还原酶法测定血清NO含量（μmol/L）。以上实验均严格按试剂盒说明操作。
       1.6 统计学处理  
       应用SPSS 11.5软件，实验数据采用±s表示，各组间比较采用方差分析（Analyisi of variance,ANorA)法，各组之间两两比较，采用q检验，P＜0.05为有统计学意义。
       2  结果
       2.1 缺血再灌注组和银杏达莫组心电图的比较缺血再灌注组和银杏达莫组再灌注60 min，以心电图ST段恢复接近正常基线为显效，则缺血再灌注组有5例显效，银杏达莫组中有7例显效。
       2.2  3组大白兔血浆中MDA含量，vWF活性及血清NO含量的比较Ⅱ组血浆中MDA含量、vWF活性明显高于Ⅰ组(P＜0.01)，而血清NO含量则显著低于Ⅰ组(P＜0.01)；银杏达莫组MDA含量、vWF活性均明显低于Ⅱ组(P＜0.01)，NO含量则显著高于Ⅱ组(P＜0.01）。结果见表1。表1  银杏达莫对兔血浆MDA，vWF活性及血清NO含量影响的比较（略）
       3 讨论
        心肌缺血再灌注损伤的机制至今仍未完全明了，一般认为与能量代谢、细胞内钙离子超载［7］、氧自由基大量产生［8］、中性粒细胞［9］的作用以及血管内皮细胞分泌的一系列内皮因子等因素有关［10］。
        再灌注时，大量氧自由基的爆发性产生使心肌细胞膜的不饱和脂肪酸和磷脂的过氧化反应加剧，MDA大量产生，损伤组织结构和功能，从而导致内皮细胞功能障碍。本实验中观察到缺血再灌注组血浆中，MDA含量与其他两组比较有非常明显的增高，表明缺血再灌注后氧自由基产生有显著的增加，而机体对清除氧自由基的能力则有明显的降低，从而使内皮细胞发生脂质过氧化损伤，导致内皮细胞分泌功能障碍，NO分泌减少［11］；在进行银杏达莫药物干预后，在兔血浆中的MDA含量较缺血再灌注组显著降低，这多为银杏达莫一定的程度上清除氧自由基，降低过氧化自由基对内皮细胞的损伤作用，改善血管内皮细胞依赖性舒张功能所致。这些都不同程度地对再灌注心肌起到了保护作用。NO是反映内皮细胞功能的比较敏感的指标，其是内皮细胞在切应力、低氧和其他介质作用下，由L-精氨酸在一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NOS）的作用下合成的［12］，可以抑制血小板和中性粒细胞的聚集，并且有消除体内过多的氧自由基的作用。本实验观察到银杏达莫干预组的兔血浆中NO含量较缺血再灌注组有非常明显的提高，证实银杏达莫能够增加再灌注期心肌组织中NO含量，使环磷酸鸟苷升高从而导致血管舒张并抑制血管平滑肌增殖，对心肌缺血再灌注损伤的内皮细胞产生较好的保护作用。vWF一般在血管内皮细胞受损时才释放入血，与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa结合,诱导血小板聚集,使血小板能牢固地黏附于血管内皮上,使血浆黏滞性增加。因此，vWF活性和水平升高是血管内皮细胞受损的一个非常重要的标志。本实验中同样观察到，缺血再灌注组的血浆中vWF水平升高明显，预示着严重心血管事件的发生［13］。而在银杏达莫进行干预后，在兔血浆中的vWF的水平较缺血再灌注组则下降显著，证实银杏能有效地保护内皮细胞功能。
        银杏达莫注射液是将银杏叶的有效成分（Extract of ginkgo biloba, EGB）加以分离，富聚后与适量双嘧达莫（潘生丁）组方而成，其化学成分复杂，根据已有的研究成果推测其作用机制是多方面的。已知EGB中含有大量的酮化合物和萜类内酯。其中，黄酮类化合物不但是有超氧化物歧化酶活性，能清除多种自由基，而且其本身还具有明显的抗氧化活性，因而能增强心肌细胞在缺血再灌注状态下的抗损伤能力，促进内皮细胞松弛因子的释放而调节血管舒缩功能［2，14］，从而持久地扩张冠脉增加冠状动脉血流量，促进侧枝循环。银杏达莫注射液中的萜类内酯则是天然专属的血小板活化因子(Platelet-activating factor, PAF)受体的拮抗剂，它与双嘧达莫协同，可抑制血小板功能，降低血液粘滞性，改善血液流变状况；另外，还可抑制升高血栓素A-2(Raise thromborane A2,TXA2)并促进前列腺素（Prostaglandine 2, PGI2）生成，从而调节血管能力，改善组织血供［15，16］。
        综上所述，银杏达莫注射液具有显著的保护内皮细胞的作用，其对减少心肌缺血再灌注诱导内皮细胞损伤可能是通过减少心肌脂质过氧化物的形成、提高血清NO含量，而且较有效地清除氧自由基，使MDA含量降低和vWF活性降低而达到的。
        以往国内相关实验以离体兔，鼠研究较多，本次实验则采取模拟临床现场的方式制作在体兔缺血再灌注/损伤模型，并取得实验结果。综合各项实验结果可见，银杏达莫注射液在临床上心血管疾病的防治中可能具有较大的价值，但因其所含化学成分复杂，其作用又是通过多途径，多层次实现的，所以其中仍有许多的未知领域，还有待进一步研究和探索。
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