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       【摘要】 
       目的观察养肝利胆颗粒的溶石和抗菌作用。方法采用体外溶石实验观察该药的溶石作用；采用豚鼠胆色素结石模型观察口服养肝利胆颗粒对动物的成石率和胆汁成分的影响；采用体外试管法研究药物的直接抑菌作用以及含药血清和含药胆汁的抑菌作用。结果养肝利胆颗粒体外能溶解胆色素型、胆固醇型和混合型结石;体内能降低模型豚鼠的成石率，升高胆汁中总胆汁酸的量，降低总胆红素和游离胆红素含量；药物对痢疾杆菌、变形杆菌、大肠杆菌等有直接抑制作用；含药血清和含药胆汁对大肠杆菌、痢疾杆菌等有较强的抑菌作用。结论养肝利胆颗粒治疗胆囊炎主要的作用机理是其具有溶石和抗菌作用。
       【关键词】  养肝利胆颗粒； 胆囊炎； 溶石； 抗菌； 作用机理
       Studies on Mechanism of Yang-Gan-Li-Dan Granule on Treating Cholecystitis
       GAO Jianping，JIN Ruomin，ZHU Peiting, WU Yaoping，SHEN Wei,CHEN Yanyan
       (1.Shanghai University of TCM, Shanghai 201203，China;2.Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200032，China）
       Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Yang-Gan-Li-Dan Granule  (YGLDG) on litholysis and bacteriostasis. MethodsThe effect of the granule on litholysis was tested in vitro. The model of bile pigment calculus in guinea pigs was established,and the effect of the granule on anti-lithogenesis and on bile components was also observed in vitro. By adding the granule dilution, the drug contained serum and bile, which were prepared from the rats given the granule per os, directly into the culture medium, the anti-bacteria effect of the granule was evaluated.ResultsIn vitro, YGLDG solution could increase the litholytic effect on human bile pigment calculus, chelecsterol calculus and combined calculus. In vitro, it could inhibit lithogenesis in guinea pigs, elevate the level of total bile acid and reduce the levels of total and free bilirubin. In vitro, YGLDG showed the bacteriostatic effect for Bacillus dysteriae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus etc. The drug-contained serum and bile had the obvious bacteriostatic effect on Escherichia coli, Bacillus dysteriae etc.ConclusionThe results show that the main mechanisms of YGLDG on treating cholecystitis are related to its effects on litholysis and bacteriostasis.
       Key words:Yang-Gan-Li-Dan Granule (YGLDG);   Cholecystitis;   Litholysis;   Bacteriostasis;   Mechanism
        胆囊炎是胆道系统常见疾病，其发生和发展的主要原因多与胆囊结石和细菌感染等有关［1～3］。养肝利胆方是上海中医药大学附属龙华医院名中医朱培庭教授多年的临床经验方，主要由白芍、首乌等中药组成，适用于属于肝阴不足之证的胆道感染和胆石症。临床实验显示该方对于胆囊炎和胆石症治疗的总有效率达90%以上［4］。已有研究证实养肝利胆颗粒具有抗炎、镇痛、解痉以及保肝利胆等作用［5，6］，证明该方对胆囊炎的常见临床症状和病理生理异常具有改善作用。为进一步探讨其治疗胆囊炎的作用机理，笔者对养肝利胆颗粒溶石防石和抗菌等作用进行了研究。结果报道如下。
       1  材料与仪器
       1.1  试剂和药物 
       养肝利胆颗粒（干膏粉），四川美大康药业股份有限公司提供，批号020301。每克干膏粉相当于4 g生药（以下简称养肝利胆）。胆宁片，上海中药制药一厂生产，批号000715。熊去氧胆酸片，上海黄河利亚制药有限公司生产，批号000101。头孢他啶，粉针剂，ELI LILLY DO BRASIL LTDA.生产，批号100600C。各药物用蒸馏水配制成相应的浓度备用。乌拉坦，中国医药（集团）上海化学试剂公司生产，批号C20021104。
       1.2  仪器
        
       BTR-815型生化分析仪，西班牙临床诊断有限公司产品。微量分光光度仪（酶标仪），美国MD 250型。
       1.3  动物 
       Wistar大鼠，体重200～300 g；豚鼠，体重250～320 g，雌雄皆用，均由上海中医药大学实验动物中心提供，合格证号分别为医动字02-24-4号和20-60号。
       1.4  其他 
       胆色素型、胆固醇型、混合型人体结石，均由上海中医药大学附属龙华医院提供。50 g致石饲料（自制）中，含正常饲料45.43 g，致石性药物4.57 g(其中有酪蛋白1 g，蔗糖1.5 g，猪油1 g，微晶纤维素1 g，胆酸0.02 g，胆固醇0.05 g)；正常饲料由上海申旺实验动物中心提供。金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，变形杆菌，绿脓杆菌，痢疾杆菌，溶血性链球菌，粪链球菌，肺炎杆菌，由上海市防疫站和卫生部药品生物制品检定所提供。营养肉汤培养基，营养琼脂培养基，血清肉汤培养基，血清琼脂培养基，由上海第二医科大学微生物教研室自制。
       2 方法
       2.1 溶石
       2.1.1  体外溶石作用［7］   
       取人胆色素型、胆固醇型和混合型3种结石，洗净，80℃恒温干燥24 h，称取100～101 mg（W1）结石装入含有经60Co辐照灭菌的药物或生理盐水10 ml的小瓶内，随机分为正常对照组，养肝利胆大、小剂量组，胆宁片组和熊去氧胆酸组。将小瓶置于37℃恒温箱中，每两天无菌操作换药液或生理盐水1次，共30 d，末次换药或生理盐水后48 h取出结石，冲洗干净后同前法烘干，称重（W2），计算溶石率。
       
       溶石率（%）=W1-W2W1×100%
       2.1.2 体内溶石作用  
       取健康豚鼠，随机分为正常对照组，模型对照组，养肝利胆大、中、小剂量组和胆宁片组。除正常对照组动物每天喂以正常饲料外，其它各组动物均喂以致石饲料制备豚鼠胆色素结石模型［8］。同时各组动物分别灌服生理盐水或不同药物（见表2）10 ml/kg，1次/d，连续6周。末次给生理盐水或药物24 h后，称鼠体重，各鼠腹腔注射25%乌拉坦麻醉，剖开胆囊观测其成石情况，同时取胆汁作胆汁成分检测。
       2.2  抑菌
       2.2.1 体外直接抑菌作用［9］将养肝利胆、胆宁片分别用生理盐水溶解稀释至200 mg/ml，再加等量的营养肉汤或血清肉汤，经115℃30 min消毒灭菌。采用试管稀释法，用微量加样器取制备好的菌液0.1 ml(相当于108CFU/ml)加至已对倍稀释的各受试试管中（各管样品的稀释度为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256），同时设肉汤对照管和待测药物原液对照管。将试管置35℃孵育48 h后观测结果，求MIC。
       2.2.2 体外药物血清抑菌作用    
       
       含药血清的制备：取健康Wistar大鼠，随机分为正常对照组、养肝利胆组、头孢他啶组。前两组分别灌胃给予蒸馏水或养肝利胆28.8 g生药/（kg·d），
       每次给药容量为9 ml/kg，2次/d，连续7次。末次给蒸馏水或药后1.5 h，腹腔注射25%乌拉坦麻醉动物，腹主动脉取血；头孢他啶（1.8 g/kg）组腹腔注射给药，给药容量为4.5 ml/kg，30 min后，同法取血。离心分离血清，置于56℃水浴中灭活30 min，备用。
         
       体外抑菌作用  ：将装有1 ml营养肉汤试管分为4组，依次为正常对照组、养肝利胆组、头孢他啶组和空白对照组，分别加入空白血清、含养肝利胆血清、含头孢他啶血清和营养肉汤各1 ml。按“2.2.1”方法将各菌液接种至各试管中，将试管置35℃孵育，分别于0，6，12 h和24 h后取出，参照文献［9］用分光光度仪在波长590 nm下测定其OD值。
       2.2.3 含药物胆汁抑菌作用   
        含药胆汁的制备：取健康豚鼠，分组和给药量同“2.2.2”项中“含药血清的制备”项下，前两组分别灌胃给予蒸馏水或养肝利胆，2次/d，连续8次，末次给蒸馏水或药后2 h，腹腔注射25%乌拉坦麻醉动物，从胆囊中抽取胆汁；头孢他啶组腹腔注射给药1次，1.5 h后，同法取胆汁，并将胆汁按1∶8比例稀释备用。
        体外抑菌作用：取96孔细胞培养板，将加入100  μl营养肉汤培养基的培养孔分为4组，依次为正常对照组、养肝利胆组、头孢他啶组和空白对照组，分别加入空白胆汁、含养肝利胆胆汁、含头孢他啶胆汁和营养肉汤各100 μl。取制备好的菌液(相当108CFU/ml)，稀释成1∶100浓度，用微量加样器分别取100 μl检测菌液加至各孔中，将96孔细胞培养板置35℃孵育，分别于0，8，24 h后取出，参照文献［9］，用分光光度仪在波长590 nm下测定其OD值。
       2.3  统计方法   
       实验结果中，计量资料用±s表示；两组间比较用t检验；多组间比较用单因素方差分析；计数资料用四格表精确检验法检验。
       3  结果
       3.1  溶石
       3.1.1  体外溶石作用  
        
       实验结果显示养肝利胆颗粒对3种人体结石均有显著的溶石作用，胆宁片与熊去氧胆酸亦有明显的溶石作用。结果见表1。表1  养肝利胆颗粒对各类结石溶石率的影响(略)
       3.1.2 体内溶石作用 
       结果显示模型组动物体重减轻，成石率明显升高，胆汁成分中，总胆汁酸含量降低，总胆红素和游离胆红素升高，则胆结石模型成功。养肝利胆和胆宁片组动物健康状况良好,体重生长正常，两者均可明显降低模型动物的成石率，升高模型动物胆汁中总胆汁酸，降低总胆红素和游离胆红素的异常升高。与模型组比较，差异显著，表明药物均有预防结石形成的作用。结果见表2～3。表2  养肝利胆颗粒对豚鼠胆囊成石率及体重的影响(略)表3   养肝利胆颗粒对豚鼠胆汁成分的影响(略)
       3.2  抑菌
       3.2.1  体外直接抑菌作用  
       实验结果显示养肝利胆颗粒有一定的抑菌作用，对痢疾杆菌、大肠杆菌、变形杆菌作用较对其他受试菌作用强，胆宁片也有一定抑菌作用。结果见表4。表4   养肝利胆颗粒体外抗菌活性(略)
       3.2.2  体外药物血清抗菌作用   
       结果显示，含药血清均能降低细菌培养液的OD值，表明养肝利胆颗粒有一定的抗菌作用，其中对大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌作用较对其他受试菌作用强，头孢他啶对4种细菌均有较强的抑菌作用。结果见图1～4。
        细菌增长率（%）=OD值n小时-OD值0小时OD值0小时× 100%
       3.2.3  含药胆汁体外抑菌作用   
       结果显示含养肝利胆或头孢他啶的胆汁均能降低大肠杆菌、葡萄球菌、痢疾杆菌培养液的OD值，表明有一定的抗菌作用。结果见图5～8。
       4  讨论
        胆囊炎的发病原因主要从胆囊排空受阻开始，包括结石机械损伤，胆汁淤积引发胆囊内高压、代谢障碍、细菌感染及神经因素等，其中结石造成胆囊管梗阻是最常见的病因［1，2］。另外胆囊炎和胆囊结石两者往往互有联系互为因果，胆囊炎的主要类型为结石性胆囊炎，而胆囊结石通常又有炎症的表现［1～3］。因此对结石性胆囊炎的治疗，溶石是其主要措施之一。
        胆汁是由肝脏分泌的一种复杂液体，含有胆固醇、胆汁酸、磷脂、胆红素等成分。正常情况下这些物质可以溶解于胆汁中，但是在不正常条件下，胆汁中的部分成分变成不溶性的物质并形成沉淀，如胆红素含量增高，特别是游离胆红素可与钙结合成不溶性胆红素钙析出，如果沉淀不断形成，沉淀复合物长大，将最终生成胆色素结石。胆汁中胆汁酸是其重要成分，它占胆汁干重的85%左右。胆汁酸是胆红素、胆固醇等物质的助溶剂，因此胆汁成分中，胆汁酸和胆红素的变化与胆色素结石密切相关。
        本研究中，采用体外溶石的方法，可以直接观察药物对于各种结石的溶解作用。结果表明养肝利胆颗粒能溶解胆色素型、胆固醇型和混合型结石，其中溶解胆色素型结石作用较强；体内实验中，采用低蛋白饮食导致动物营养不良，肝细胞浊肿变性的同时，甘氨酸、胆固醇等原料供应不足，致使肝脏合成胆汁酸的量减少，胆红素体内代谢异常，造成胆红素溶解度下降从而形成胆色素结石动物模型。实验中以动物结石率以及胆汁中的胆汁酸和胆红素的变化为指标来观察药物的作用。结果证实该药能明显降低模型动物的成石率，与体外溶石结果一致，可降低胆汁中总胆红素、游离胆红素及其百分比，升高胆汁中总胆汁酸，证实了该方可抑制胆石形成。
        细菌感染是胆囊炎的主要致病因素之一。细菌感染的发生和发展部分原因是由胆结石造成胆囊管阻塞引起胆汁淤滞，加上组织损伤及化学炎症导致黏膜抵抗力下降。胆囊炎发作时胆囊内胆汁的细菌培养阳性率高达80%～90%，其中肠源性革兰氏阴性杆菌为最常见的致病菌。细菌在酶的作用下使结合胆汁酸转变成有毒的游离胆汁酸，也可加重组织损伤和炎症［2］。
       
       采用体外试管法，将药物直接加入被检细菌培养液中，可测定药物对细菌的直接作用。根据液体中细菌数量与其吸光度呈正比的原理，采用比色法，将含药血清或含药胆汁加入被检细菌培养液中，经不同时间培养后，用分光光度仪测定其培养物吸光度的变化，来反映含药血清或者含药胆汁对细菌的抑制作用。结果证实养肝利胆颗粒对痢疾杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等均有一定的抗菌作用。本研究中采用胆汁进行抑菌实验，该方法特点是不仅反映了药物的体内过程，兼顾到药物的作用靶点在胆道，证实其对胆道致病菌的有效性。
        综上所述，胆囊炎最主要的致病因素是胆结石和胆道细菌感染。本研究结果表明养肝利胆颗粒具有防石溶石和抗菌作用，结合对胆汁中与结石形成密切相关的成分的测定和对含药胆汁抗菌作用的研究，提示该药治疗胆囊炎的主要作用机理是溶解胆结石和抗胆道细菌感染。该研究为其用于胆囊炎治疗提供了药理学依据。
        致谢：本研究体外抗菌实验得到了第二医科大学微生物教研室肖家祁老师的支持和指导，在此深表感谢。
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