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       【摘要】 
       目的研究寨卡有效部位提取物体外抑制人结肠癌LoVo细胞的量效和时效关系，并对其可能的作用机制进行初步探讨。方法寨卡有效部位提取物不同浓度、不同时间分别处理LoVo细胞，以MTT法和荧光显微镜观察其对细胞生长增殖的抑制作用，利用分光光度法检测试剂盒检测Caspase-3和Caspase-9的活化程度。结果寨卡有效部位提取物对体外培养的人结肠癌LoVo细胞有明显的抑制作用，呈剂量和时间依赖关系，IC50值为550 μg/ml。Caspase-3 和Caspase-9的活性与药物浓度呈正相关，当浓度为1 000 μg/ml时其活性与阳性药物组基本相当。结论寨卡有效部位提取物在体外能有效抑制人结肠癌LoVo细胞的生长，并可能通过激活Caspase-3和Caspase-9诱导细胞凋亡。
       【关键词】  寨卡； LoVo细胞； 增殖； 凋亡； Caspase-3； Caspase-9
       Study on the Grouth-inhibiting Effects of the Active Fractions of Pennycress on Human Colon Carcinoma LoVo Cells in vitro
       QING Yuan, JIANG Nan,LUO Xia, ZENG Jin, XU Xiaoyan, GE Shaorong
       (1.Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment Ministry of Education, Life Science School, Sichuan University，Chengdu 610064，China; 2.Celluar and Molecular Lab of Sichuan Institute of Chinese Materia Medical, Chengdu 610064, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the concentration-effect and time-response effect of active fractions of Pennycress (ZAF) against human colon carcinoma LoVo cell and the possible mechanism in vitro. MethodsIn vitro cultured human colon carcinoma cell LoVo cells were exposed to ZAF at different concentration or different treating time, then the growth inhibiting effects of the cell were detected with MTY assay and double fluorescence staining methods, activities of Caspase-3 and Caspase-9 were studied by Assay Kit. ResultsHuman colon carcinoma LoVo cells were inhibited more significantly with increase of ZAF concentration and prolongation of culture time, IC50  550 μg/ml. ZAF could activate Caspase-3 and Caspase-9 in a concentration dependent manner. When treated with 1 000 μg/ml ZAF, activation of Caspase-3 and Caspase-9 corresponded with anti-tumor medicine Cisplatin. ConclusionZAF can inhibit the growth of the human colon carcinoma LoVo cells in vitro effectively, and trigger the activation of Caspase-3 and Caspase-9 to induce cell apoptosis.
       Key words:Pennycress;  LoVo cells;  Proliferation;  Apoptosis;  Caspase-3;  Caspase-9
       
       寨卡是一味常用藏药，为十字花科植物菥蓂［1］Thlaspi arvense Linn.的干燥成熟种子。该植物为一年生草本，据传统医药经典记载其全草均可入药，气微，味淡，性味辛、微温，具有清肝明目、清热解毒、利水消肿、和中开胃等功效。在传统藏医药应用中，其主要用于治疗目赤肿痛、流泪、肺热、咳嗽、肾热、淋病、消化不良、呕吐等病症。目前国内外尚无有关寨卡抗肿瘤作用的报道。本文研究了寨卡提取物对人结肠癌肿瘤细胞体外培养条件下的生长抑制作用，并通过Caspase-3和Caspase-9分光光度法检测试剂盒对其可能的抗癌机制进行了初步探讨，目的是为进一步的药物研发奠定理论基础。
       1  材料与仪器
       1.1  药物寨卡有效部位提取物（active fractions of Pennycress，ZAF），由四川省中医药研究院中药细胞与分子生物学实验室提供。
       1.2  人结肠癌LoVo细胞人结肠癌LoVo细胞为 ATCC菌株，编号：CCL-229，购于南京凯基生物科技发展有限公司。
       1.3  试剂与仪器Caspase-3，9分光光度法检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；RPMI-1640（GIBCO公司）；台盼蓝，胰蛋白酶，吖啶橙，溴乙啶等均为Sigma公司产品；倒置显微镜（Nikon，TS100）；二氧化碳细胞培养箱（Heraeus，BB5060UV）；酶标仪（Thermo Electron，Multiskan ）。
       2  方法
       2.1  细胞增殖抑制实验采用MTT法［2,3］进行。每个孔5.0×104个细胞，每个剂量3个重复孔，作用72 h，酶标仪于570 nm波长处测定各孔吸光度（A570），细胞抑制率（%）= （对照组A－实验组A）/（对照组A－空白组A）×100%。以药物浓度的对数和抑制率作回归方程，计算IC50。实验重复3次。
       
       按前述同样方法，将同样细胞密度的LoVo细胞分别加入300，550，1 000 μg/ml的ZAF进行培养，根据药物作用时间分为5个组，即作用0，12，24，36，48 h后，观察相同浓度ZAF在不同作用时间后对LoVo细胞的增殖抑制作用。实验重复3次。肿瘤细胞生长抑制率的计算方法同上。
       2.2  双荧光染色分析法［4,5］对数生长期 LoVo 细胞按5×105个/皿接种于35 mm培养皿，37℃培养24 h，用不同剂量的ZAF作用 48 h，0.25％胰酶消化，离心弃上清液，加入冷PBS洗2次，制成细胞悬液，吸90 μl ，加入10 μl 混合荧光染色液［100 μg/ml 吖啶橙（AO）和100 μg/ml溴乙啶（EB）临用前等体积混合］，混匀，压上盖玻片，荧光显微镜下观察并摄像。
       2.3  细胞凋亡的生化分析利用Caspase-3，9分光光度法检测试剂盒（购自南京凯基生物科技发展有限公司）对Caspase-3和Caspase-9的活化程度进行检测。设实验组、阴性对照和阳性对照组，其中实验组ZAF终浓度为300，550，1 000 μg/ml；阴性对照组ZAF终浓度为0 μg/ml；阳性对照组为顺铂50 μg/ml。
       3  结果
       3.1  ZAF对LoVo细胞体外抗增殖作用的量效关系MTT结果显示，寨卡有效部位提取物抑制LoVo细胞具有浓度依赖性（图1），即药物浓度越大，对细胞的抑制越明显。作用72 h时其IC50为550   μg/ml。
       3.2  ZAF对LoVo细胞体外抗增殖作用的时效关系MTT结果显示，寨卡有效部位提取物抑制LoVo细胞具有时间依赖性（图2），即相同药物浓度下，随药物作用时间的延长，细胞生长受抑制加重。
       3.3  双荧光染色显微镜观察对照组细胞形态饱满，细胞质呈绿色，核为亮绿色，呈现荧光深浅不一的结构样特点。ZAF处理的细胞则出现凋亡细胞，并且随ZAF的剂量增高而增多：早期凋亡细胞细胞质呈绿色，细胞核染色增强，荧光明亮，呈均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构；晚期凋亡细胞着橙色并呈团缩或串珠状，胞质染成红色（图3）。
       3.4  Caspase-3，Caspase-9活化程度以ODZAF/OD阴性对照的倍数来确定给药组Caspase-3 和Caspase-9的活化程度（表1）。从表1可看出，ZAF对Caspase-3 和Caspase-9有明显的诱导激活作用，且存在明显的剂量依赖关系，随着药物浓度的增加，Caspase-3 和Caspase-9酶活活化倍数增加明显。从该实验结果可知，ZAF可能是通过激活Caspase-3 和Caspase-9的活性，从而启动Caspase家族酶的信号转导级联反应，诱导LoVo肿瘤细胞的凋亡。表1  ZAF对Caspase-3，9的活化作用（略）
       4  讨论
        寨卡为常用中药，中医传统认为其具有清肝明目、清热解毒、利水消肿、和中开胃等功效。主要用于治疗目赤肿痛、流泪、肺热、咳嗽、肾热、淋病、消化不良、呕吐等症，国内外均未见有关寨卡提取物抑制肿瘤细胞生长作用的研究。本实验针对寨卡有效部位提取物对人结肠癌肿瘤细胞的杀伤作用进行了量效关系和时效关系的考察，结果表明其杀伤肿瘤细胞的作用随药物浓度与作用时间的增加而增加。在作用时间相同时，药物浓度越高，细胞杀伤率越大；而在同一药物剂量时，随药物作用时间增加，细胞杀伤抑制率也随之增加。培养细胞荧光染色观察结果显示，高浓度ZAF作用下细胞死亡率明显高于低浓度下细胞死亡率，并且在低浓度条件下细胞已开始初现凋亡。MTT法和细胞荧光染色结果在表明细胞生长抑制趋势上是一致的。
        Caspase (cysteinyl aspartate-specific proteinase)是一组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，现已确定人体中至少存在11种，它们在细胞内以无活性的酶原形式存在，经活化后发挥各自的功能。根据Caspase在细胞凋亡中的作用，可以分为2大类：起始型(Caspase-8，9，10等)与效应型(Caspase-3，6，7等)［6］。其中，Caspase-3广泛分布于各种类型的细胞中，被称为凋亡的“执行者”， 与DNA断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。Caspase-9属于启动型Caspase，是促细胞凋亡因子。通常Caspase引起细胞凋亡的途径为死亡受体接受死亡信号，激活上游Caspase-8，导致Caspase-9激活，最终激活Caspase-3等，通过破坏细胞核纤层，直接导致细胞结构的损坏［7］。通过对细胞凋亡的生化分析显示，寨卡有效部位提取物对Caspase-3和Caspase-9都有明显的激活作用，特别对于Caspase-9的活化作用显著，推测ZAF可能是诱导了Caspase酶的活性而导致细胞凋亡的。
       
       本实验的研究结果确定了寨卡有效部位提取物体外抗肿瘤作用与抑制细胞增殖和诱导凋亡有关，其作用机制可能是通过激活Caspase的途径引起细胞凋亡，但具体机制还有待进一步研究。
       【参考文献】
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