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       【摘要】 
       目的比较中药银杏内酯A(GA)聚氰基丙烯酸正丁酯纳米球（PBCA-NP）的两种不同制备方法，同时考察稳定剂右旋糖酐-70对纳米球制备的影响。方法以稳定剂右旋糖酐-70作对比实验，采用乳化聚合法和界面缩聚法制备GA-PBCA-NP。在透射电镜下观察其形态，用高效液相－蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）测定各自的包封率和载药量，并观察GA-PBCA-NP的稳定性。结果未添加稳定剂的纳米球表面粘连团聚现象严重，难以成球；乳化聚合法制备的GA-PBCA-NP在透射电镜下观察表面圆整光滑，粒子之间不团聚，不黏连，粒径范围在90～600 nm，包封率为60.49%，载药量为18.15%；界面缩聚法制得的纳米粒表面圆整光滑，粒子之间不团聚，不黏连，粒径大小均匀，都在200 nm左右，包封率为73.87%，载药量为22.23%，两种方法制备的稳定性都较好。结论制备纳米粒过程中需加入适量稳定剂；界面缩聚法制备GA-PBCA-NP具有粒径均匀、载药量和包封率高的特点，优于乳化聚合法。
       【关键词】  银杏内酯； 聚氰基丙烯酸； 正丁酯； 纳米球； 乳化聚合法； 界面缩聚法
       Comparison of the Preparation Methods of Brain Targeting Ginkgolide A-polybutylcyanoacrylate Nanoparticles
       PAN Jian, TIAN Tian,CHEN Yan
       （Engineering Research Center of Bio-process,Ministry of Education,Hefei 230009,China）
       Abstract：ObjectiveTo compare the ginkgolide A(GA) polybutylcyanoacrylate nanoparticles(PBCA-NP) produced by the two methods so as to investigate the effect of stabilizer dextran 70 on preparation.MethodsGA was incorporated into PBCA-NP by emulsification polymerization and interfacial polymerization methods separately.The effect of dextran 70 on preparation wasinvestigated.Transmission electron microscopy was employed to study the shape.The bedding ratio and drug loading were determined with HPLC-ELSD.The stability of GA-PBCA-NP was also studied.ResultsDue to the agglomerationg of nanoparticles with no stabilizer,it was difficult to preparate.GA-PBCA-NP produced by the two methods both had spheric and smooth outer appearance,uniform distribution,nonadherence and stability.The diameter,ebeding ratio and drug loading in GA-PBCA-NP produced by emulsification polymerization and interfacial polymerization methods were 90～600 nm and 200 nm,60.49% and 73.87%,18.15% and 22.23%,respectively.ConclusionIt is important to add dextran 70 in preparation.The interfacial polymerization method which is better than emulsification polymerization method is an effective method to produce the GA-PBCA-NP.
       Key words：Ginkgolide;  Polybutylcyanoacrylate;  Nanoparticles;  Emulsification;  Polymerization method;  Interfacial polymerization method
        纳米球(nanospheres, NP)是一类以天然或合成高分子材料为载体的固态胶体微粒，粒径大约在10～1 000 nm。NP是一种控释的胶体给药系统［1］，与其它微粒给药系统比较，NP具有更多优点，比如生物相容性好，可生物降解，生物利用度高［2］，肝脾靶向作用等。近年来，有关中药脂质体的研究显著增多［3］，但关于将中药有效成分包封于NP的研究少有报道。
       
       银杏内酯 (ginkgolides)为银杏叶提取物中主要的药效成分，为二萜内酯化合物，是一种强血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)受体拮抗剂，对于心脑血管疾病，具有显著的疗效［4］。银杏内酯不溶于水，制备成PBCA纳米球后可提高生物利用度及用于静脉注射。在纳米粒脑靶向给药系统的体内研究中，聚氰基丙烯酸酯纳米粒是体内脑部给药已经获得成功的微粒系统，使用此微粒系统用于脑部给药的首个药物是六肽dalargin。
       
       本研究考察了稳定剂右旋糖酐-70对纳米球制备的影响，并利用乳化聚合法和界面缩聚法制备银杏内酯的新剂型-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米球，并比较了两种方法制备的GA-PBCA-NP的纳米球表面形态、粒径、包封率和载药量、稳定性等性质的不同。现报道如下。
       1  材料与仪器
        银杏内酯A标准品(＞98%，中国药品生物制品检定所)。聚氰基丙烯酸正丁酯（PBCA）（广州白云医用胶公司）。吐温-80（SIGMA公司）。右旋糖酐-70（AMERSHAM公司）。其他试剂均为分析纯。X-650扫描电子显微镜（日本日立公司）。JEM-2011高分辨透射电镜（日本电子公司）。3K15高速冷冻离心机（SIGMA公司）。Waters 515 HPLC（Waters公司）。2420蒸发光散射检测器）。ELGA超纯水机（Veolia Water System公司）。
       2  方法与结果
       2. 1  GA-PBCA-NP的制备 
       按以下两种方法分别制备：
       2.1.1  乳化聚合法称取一定量的银杏内酯 A，溶解于适量的无水乙醇中，加入表面活性剂吐温 -80，稳定剂右旋糖酐-70 制成水溶液，用稀盐酸调节pH为3；取聚氰基丙烯酸正丁酯用无水乙醇溶解，将其缓缓滴入上述水溶液中，在磁力搅拌器上搅拌3 h，加入附加剂NA2S2O5，用稀氢氧化钠溶液调 pH 为7，微孔滤膜抽滤，高速冷冻离心，得产品。同法，不加入稳定剂，作对比实验。
       2.1.2 界面缩聚法三酸甘油酯与盐酸溶液溶于无水乙醇中组成油相，将PBCA缓慢滴加至此酸性油相中，另加入适量右旋糖酐-70。为中和此有机相的酸性，将表面活性剂溶于缓冲溶液制成水相。搅拌下将油相慢慢滴加到水相中，磁力搅拌器搅拌后微孔滤膜抽滤，高速冷冻离心，得产品。
       2.2  电镜观察
       取以上 3 组GA-PBCA-NP滴加至带膜铜网上，在扫描电镜及透射电镜上观察并拍摄照片。未添加稳定剂的纳米球表面粘连团聚现象严重，难以成球，见图1；乳化聚合法和界面缩聚法制备的 GA-PBCA-NP 在透射电镜下观察均表面圆整光滑，粒子之间不团聚，不粘连。但前者粒径范围在90～600 nm，见图2；后者都在 200 nm 左右，粒径更均匀，见图3。
       2.3  包封率（ebedding ratio,ER）与载药量（drugloading,DL）测定
       2.3.1  色谱条件色谱柱为Symmetryshield-RP18（Waters公司，3.9 mm×150 mm,5 μm）；流动相为甲醇∶水 (30∶70, V/V)；流速:1.0 ml/min;柱温:室温；进样量5 μl；蒸发光散射检测器检测参数：增益值135；气压25 psi；喷雾器级别60%；漂移管温度80℃。
       2.3.2  回归方程分别精密吸取银杏内酯A对照品溶液一定量，用甲醇配制成浓度为0.05～0.5 mg/ml的对照品系列溶液。按上述色谱条件分别测定。以得到的峰面积积分对数值对银杏内酯A的进样量对数值作线性回归，求出回归方程为lgY=4.779 8lgX+15.321, r= 0. 9962，表明银杏内酯A在0.05～0.5mg/ml的范围内线性关系良好。
       2. 3. 3  计算方法［5］低温超速离心（4℃，15 300 r/min,15 min）分离GA-PBCA-NP样品，用HPLC-ELSD 法测定上清液中GA的含量，色谱图见图4～5。按下式计算各GA-PBCA-NP的包封率和载药量，计算结果见表1。表1  载药量及包封率检测结果（略）
       
       ER（%）=W0-W1W0×100%=C0-C1C0×100%
        DL（%）=W0-W1WBCA×100%=C0-C1CBCA×100%
       上式中 ：ER%为纳米球药物包封率；DL%为纳米球载药量；W0为分离前纳米球中GA质量（B液）；W1为分离液流份中的GA质量（A液）；WBCA为分离前纳米球中BCA的质量；C0为分离前溶液中的GA浓度(B液中GA的浓度)；C1为分离液流份中的GA浓度（A液中GA浓度）；CBCA为纳米球中的BCA浓度。
       2.4  稳定性实验常温下放置十分稳定，并具有良好的抗光照、抗湿热性。温湿条件下放置 30 d 仍具有较高的载药量，低温冷冻30 d 后药物渗漏接近10%，可能长时间冷冻对纳米球结构有影响。室温稳定实验前后样品载药量及外观未见有显著改变。
       3  讨论
        聚氰基丙烯酸正丁酯因氰基吸电性强，相邻的碳原子呈强正电性，遇阴离子如OH-则自动聚合成球［6］；右旋糖酐-70可以在水中形成右旋糖酐阴离子，参与催化聚合，BCA受大量阴离子催化，聚合较快，形成众多小核，快速生成的小核再次聚结成较大的毫微粒。在制备过程中加入稳定剂右旋糖酐-70可以避免纳米球团聚粘连。是因为右旋糖酐是葡萄糖聚合而成的链状多聚体，是一种天然表面活性剂。右旋糖酐解离后的阴离子可取代OH-离子作为聚合反应的引发剂，由于右旋糖酐阴离子比OH-离子大，空间位阻大，可使聚合反应速率减慢，防止纳米粒粘连继续聚合，保持较小粒径。
        本研究分别采用乳化聚合法和界面缩聚法制备GA-PBCA-NP，发现两种方法均适于制备GA-PBCA-NP，但界面缩聚法制备的纳米球粒径较均匀，载药量和包封率也较乳化聚合法制备的高，因此界面缩聚法优于乳化聚合法。
        当前市面上的银杏药物制剂大多是传统的给药方式，全身分布，局部血药浓度低，达不到很好的治疗效果。并且由于缺乏组织特异性和病变部位的靶向性,药物用量大, 有效成分的利用率较低,有时对非靶器官甚至会带来很大的毒副作用。因此,发展靶向性药物载体,特异性将银杏内酯有效成分导入脑部病变部位,是当前研究的趋势和方向。纳米球是一种新型的药物载体，可按与微生物类似的途径（融合、内吞）进入脑内［7］ 。本实验已优选出GA-PBCA-NP的制备方法，但其是否能使银杏内酯有效成分输送到脑内的药量增加，将进一步通过实验进行验证。
       【参考文献】
         　　［1］Muller RH, Mader K, Gohla S. Solid lipid nanoparticles (SLN ) for controlled drug delivery- a review of the state ofthe art［J］. Eur J Pharm Biopharm, 2000,50: 161.
       
       ［2］Muller RH, Maassen S, eyhers H, et al. Cytotoxicity of magnetite loaded polylactide, polylactide/glycolide garti-cles and solid lipid nanoparticles(SLN )［J］.Int. J Pharm,1996,138：85.
       
       ［3］Olbrich C，Bakowsky U, Lehr CM .et al Cationic solid lipid nanopattirfes can effictiently bind and transfect plasmid DNA［J］.J Controlled Release.，2001,77:345.
       
       ［4］黄沛力.GC-MS测定家犬血浆中银杏内酯A、B的含量［J］.分析测试学报,2004,23(9):23.
       
       ［5］吕伏生，陈 伟.ELSD检测法测定银杏酮酯注射液银杏内酯A,B的含量［J］.中国药科大学学报,2001,32(1):34.
       
       ［6］桂卉,范学工.链霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒的制备工艺研究［J］.解放军药学学报，2004,20（6）：169.
       
       ［7］石歆莹,范学工.纳米粒跨越生物屏障研究进展［J］.中国药科大学学报,2002,33(3):169.