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       【摘要】 
       目的研究中药组方芪芍合剂对大鼠II 型胶原诱导型关节炎(CIA)炎症及血管新生相关因子的影响。方法用II 型胶原和完全弗氏佐剂建立CIA 模型，造模次日始用芪芍合剂(40 g·kg-1·d-1×4周)灌胃，模型对照组分别给予等量的生理盐水。于造模第4周大鼠心脏采血分离血清进行Western Blot 检测大鼠体内IL-1β，TNFα，VEGF，MMP-2以及MMP-9的相对表达水平。结果中药可以降低大鼠IL-1β，TNF-α，VEGF ，MMP-2，MMP-9 的表达。结论IL-1β，TNFα，VEGF ，MMP-2，MMP-9 共同促进CIA 大鼠炎症的形成和发展，中药可能通过抑制它们的表达而发挥抗炎及抗血管新生作用。
       【关键词】  芪芍合剂 关节炎 II型胶原诱导型 血管新生 相关因子 大鼠
       类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种常见的可致残的慢性炎症性疾病，与多种免疫失调密切相关。我国患病率为0.32%～0.36%。RA主要病理特点是在炎症刺激下，关节滑膜细胞增生，衬里层增厚，多种炎细胞浸润，滑膜细胞合成TNF-α，IL-1等多种细胞因子促进滑膜成纤维细胞增殖和微血管新生而形成血管翳，后者从滑膜边缘逐渐扩展覆盖于关节软骨表面，一方面中断了关节的营养，另一方面通过分泌一些酶导致软骨和骨质的破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。
       
       本研究采用中药组方芪芍合剂治疗用Ⅱ 型胶原和完全弗氏佐剂(CFA)构建CIA 大鼠模型，4周后用Western Blot 的方法分别检测各组大鼠血清中TNFα，IL-1β，VEGF，MMP-2，MMP-9因子的水平。研究中药组方对RA 的炎症及血管新生相关因子影响。
       1  材料
       1.1  药物芍合剂由桂枝芍药知母汤和黄芪桂枝五物汤加减组成：黄芪30 g，当归10 g，川芎10 g，白芍15 g，丹参15 g，桂枝10 g，知母10 g ，秦芎10 g，桃红10 g，牛膝10 g，白芥子10 g，甘草10 g等，水煎后浓缩至4 g·ml-1生药，4℃ 保存备用。
       1.2  动物雌性近交系SD 大鼠，清洁级，4～6周龄，平均体重为（190±15）g，购于南京医科大学实验动物中心(合格证号：苏动质字第97001号)。
       1.3  试剂Ⅱ型胶原(上海本草生物医学工程研究所产品)，卡介苗（BCG）(兰州生物制品所产品)，高、低分子量标准蛋白参照物(上海华舜生物工程有限公司产品)，TNFα，IL-1β，VEGF，MMP-2，MMP-9兔抗多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司产品），羊抗兔AP 多克隆抗体(工作浓度为1∶1 000) （武汉博士德生物工程有限公司产品）。
       2  方法
       2.1  II型胶原的配制取液体石蜡8 ml 和羊毛脂4 ml混匀高压灭菌。加入卡介苗（BCG）120 mg，混匀。将II型胶原60 mg溶于12 ml 的0.01 M 乙酸中，浓度为5 mg·ml-1，4℃ 过夜，充分溶解，然后和完全弗氏佐剂（CFA）等体积混合，乳化，制成Ⅱ型胶原乳剂24 ml，每毫升含5 mg BCG和2.5 mg II 型胶原。
       2.2  实验动物的分组取40只大鼠，随机分为4 组：A组：模型组； B组：模型+ 生理盐水组； C组：模型+中药组； D组：生理盐水造模对照组（正常对照组）。
       2.3  动物模型的建立以每只0.1 ml的剂量在鼠的右后足跖皮内注射(II 型胶原每只0.25 mg)。21 d时以每只0.1ml的剂量尾根部皮内多点激发注射1次。对照组以生理盐水注射，方法同模型组。所有动物均在清洁环境中饲养。
       2.4  中药治疗参照文献［1,2］于造模第2天，B 组予生理盐水灌胃；C 组采用中药灌胃，用药剂量按“动物体表面积比率换算等剂量法”，由正常人每日常用剂量换算得出：40 g·kg-1，1次/d，共4 周。大鼠于第4周心脏采血2 ml，室温静置1 h，4℃ 以3 000 r/min，10 min，取上清，分装，-80℃冻存。
       2.5  Western Blot 检测大鼠血清用Lowry"s法测定蛋白含量，按每孔40 μg·20 μl-1上样，经12% 十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙酰胺凝胶电泳分离, 冰浴中以260 mA 电转70 min，转到PVDF膜, 3% BSA 室温封闭1 h, 一抗（抗TNF-α，IL-1β，VEGF，MMP-2，MMP-9抗体）为兔抗多克隆抗体（工作浓度均为1∶200），4℃孵育过夜，二抗为羊抗兔AP 多克隆抗体（工作浓度为1∶1 000），室温孵育2 h，将PVDF 膜浸入显色液显色待条带清晰时终止显色，晾干，扫描。
       2.6  统计学处理所有统计均在SPSS 12.0 及Excel 2003 软件中完成，以P<0.05 为有显著性差异。PVDF膜经扫描成像后用GIS 凝胶图象处理系统对TNF-α，IL-1β，VEGF，MMP-2和MMP-9条带进行半定量分析，以对照组（D 组）条带为标准(100)，各组条带密度分析所得值与对照组（D 组）之间采用单样本检验（One-Sample Test）, 各模型治疗组与模型组（A组）之间多样本方差分析（One-Way ANOMA）进行统计学处理。
       3  结果
       3.1  大鼠一般情况及关节炎症状观察
       造模大鼠饮食及活动减少，后期可见毛发枯燥无光泽、负重困难、关节活动障碍等，中药治疗组的上述表现较轻。模型组大鼠造模后第3天陆续出现注射足踝、趾、膝关节淤斑、红肿及轻度肿胀，于第7～10天开始红肿加重，关节表面皮肤发亮充血，部分大鼠向对侧后肢及双前肢蔓延，部分大鼠可在耳廓或尾部扪及皮下结节，在第21天加强免疫后上述症状进一步加重，但中药治疗组没有模型组明显。A、B、C组各有1只大鼠死亡。
       3.2  Western Blot检测结果
       血清中的TNF-α，IL-1β，VEGF，MMP-2和MMP-9的Western Blot检测结果见图1，在未造模情况下（D组），大鼠体内TNFα，IL-1β，VEGF，MMP-2和MMP-9均有少量表达，在造模后5种因子的表达水平显著增加（A和B组），而中药治疗组（C）与CIA模型组（A）以及模型对照组（B）相比，血清中的TNFα，IL-1β，VEGF，MMP-2和MMP-9的水平显著降低。
       
       半定量分析结果由表1可见，造模后，大鼠体内TNF-α，IL-1β，VEGF，MMP-2和MMP-9表达量（A组和B组）与非模型对照组比较有显著性差异（P<0.01）；而在中药治疗组，CIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、VEGF、MMP-2和MMP-9均显著下调，与非治疗组模型大鼠比较均有显著性差异（P<0.01）。模型对照组（B组，生理盐水组）对模型大鼠上述5种因子的表达无明显影响，与模型组比较均无显著性差异（P>0.05）。表1  血清TNFα，IL-1β，VEGF，MMP-2和 MMP-9相对含量（略）
       
       4  讨论
          
       RA是一种累及全身多关节的慢性炎症性疾病，其发病机制仍未完全阐明，我国的患病率及致残率均较高，严重威胁着人们的健康，目前除抗炎及对症治疗外还没有特效的治疗方法。RA早期的一个主要病理变化是炎症介质激活内皮细胞、蛋白酶降解血管内皮基质、内皮细胞趋化从而导致滑膜血管新生、细胞增殖，细胞因子、趋化因子、生长因子、黏附分子、蛋白酶、蛋白酶抑制剂和基质蛋白都参与了这一过程。关节软骨表面的血管新生是该过程的中心环节，在RA病程的早期便已开始，它主要取决于促血管生长因子和抑制血管生长因子间的平衡［3～5］。
       
       本实验结果显示，RA的滑膜细胞增殖可能与高水平的细胞因子产生有关。有多种细胞因子参与了滑膜细胞增殖的过程，这些因子通过与靶细胞上的特异性受体结合来发挥生物学效应。它们与其受体结合而活化，激活相应的信号传导通路，启动基因的转录，从而表达细胞因子的特定功能。由单核-巨噬细胞产生的细胞因子如IL-1β，TNF-α等在RA的滑膜急性炎症、滑膜纤维化、骨和软骨破坏的病理改变中发挥重要作用。RA发病时，滑膜细胞的IL-1β，TNF-α等细胞因子合成迅速增加，并释放入滑膜和血液中［6］。本实验也证实了CIA大鼠分泌的TNF-α，IL-1β细胞因子水平过高，这是引发其病理过程的首发因素。
       
       RA病程中，TNF-α与IL-1扮演重要作用，常常是同时合成和分泌的，两者不但以自分泌的方式刺激巨噬细胞增加自身的产生，而且也能相互促进体内的表达。RA 发病时，滑膜细胞的IL-1，TNF-α等细胞或炎症因子合成迅速增加，并释放入滑膜和血液中，血清中TNF-α，IL-1β的水平与RA 发病及病程进展密切相关［7～9］。  研究表明［10］，TNF-α，IL-1β可以直接或间接调控VEGF，MMP-2，MMP-9等因子的表达，促进滑膜血管新生，增加血管通透性，促进滑膜慢性炎症的形成和发展。联合使用IL-1受体拮抗剂，TNFα 抗体后RA 患者的关节腔滑液的IL-6和 MMP-2明显降低，且二者联合使用较单用任一试剂效果要好［8］。因此，RA 病程中TNF-α，IL-1β与其它因子之间可能存在反馈机制，相互调节，相互作用，共同在RA 病程中起作用。
       
       RA在祖国医学中属中医“痹证”范畴。“正虚邪凑”是其发病的根本原因，人体素体虚弱，表卫不固，正气不足，腠理不密，感受风寒湿邪日久，邪气入里，注于经络，留于关节，以致经络闭阻，气血运行不畅，而引起的肌肉、筋骨、关节酸痛、重着、麻木、强直、屈伸不利，甚至关节变形。本实验组方芪芍合剂源于桂枝芍药知母汤和黄芪桂枝五物汤加减而来，具有祛风散寒除湿、温阳行痹和柔筋定痛等功效［11～15］。本方重用黄芪益气固表，一方面扶正助驱邪，另一方面又可防邪再犯；方用桂枝祛风寒除湿，白芥子散寒化痰，活血止痛，白芍、知母、甘草养阴，柔筋止痛，知母、芍药清热养阴，生姜、甘草和胃调中。当归、丹参、川芎、桃红、牛膝等具有养血补血、温阳柔肝、活血化瘀、舒筋活络，温通经脉的作用，诸药合用具有益气固表、除湿通络之功。现代药理研究证实以上药物均有抗炎、镇痛的功效，可改善RA 病人微循环,明显抑制关节炎症，改善血液的流变性，抑制纤维组织增生，促进纤维组织降解和细胞再生的作用，另外还可以提高血浆纤维联结蛋白水平，增加网状内皮系统吞噬功能，提高免疫力［11，15，16］。
       
       本方组方严谨，切合病机、配伍得当，主次分明，标本兼顾，扶正祛邪。本研究表明该方能明显降低模型大鼠血清中TNFα，IL-1β，VEGF，MMP-2，MMP-9的相对含量，而以上的这些因子均参与了RA的病理过程，提示本中药组方可能通过抑制以上因子而发挥抗炎和抗血管新生的作用从而达到阻止RA 病程发展的目的。
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