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       【摘要】 
       该文对黑籽重楼Paris thibetica种内两变种——黑籽重楼原变种Paris thibetica var. thibetica与无瓣黑籽重楼Paris thibetica var. apetala在形态学及ISSR分子标记上的差异进行了研究和比较。形态特征分析表明黑籽重楼原变种与无瓣黑籽重楼在萼片长宽、花药数、花丝长等7个花器官性状方面有显著差异，但通过在主成分分析图上不能明显区分两个变种，两变种总体形态上的分化不明显。ISSR分析上，从100个ISSR引物中筛选出8个引物，在300～1500 bp间共 扩增出 36条带，其中黑籽重楼原变种特征带有5条，无瓣黑籽重楼扩特征带有8条。
       【关键词】  黑籽重楼 变种 形态差异 ISSR
       Analysis of Genetic Differentiation Based on ISSR and Morphological Markers in Paris thibetica
       CHEN Zhao, YE Ruichao, ZHANG Rui, LI Weiyang, WANG Li
       (College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China; Neijiang Normal College, Neijiang 641112, China)
       Abstract:The morphological differentiation analysis on Paris thibetica var. thibetica and Paris thibetica var. apetala was accomplished to indicate that the morphological differentiation between those two varieties were not significant , while the differentiations of the floral organs were significant. Generally, Paris thibetica var. thibetica and Paris thibetica var. apetala could not be classified by principal component analysis. In ISSR analysis, 8 proper primers were selected from 100 ISSR primers. And 36 bands were amplified by ISSR-PCR, of which length range was 300bp to 1500bp. Paris thibetica var. thibetica had 5 characteristic bands, while Paris thibetica var. apetala had 8.
       Key words:Paris thibetica;  variety;  Morphological differentiation;  ISSR
       
       重楼是延龄草科(Trilliaceae)重楼属(Paris L.)植物的统称，是一类极具药用价值的植物。《神农本草经》《本草纲目》《植物名实图考》及《中国药典》等都有所记载［1］，常用于治疗疔疮肿毒以及流行性腮腺炎等疾病。由于它还有抗癌止血，祛痰抑制细菌等功效［1］，现在是云南白药等许多中成药的主要成分［2］。 在李恒系统中，重楼属植物有24种，由于其形态变异较大，在种间、种内又有交叉重叠，这对于其形态分类及种质资源利用造成一定困难［3］。历年的《中国药典》只收载了滇重楼和华重楼2个种，实际上在民间除了少数稀有种外，几乎所有重楼属植物均能入药［3］。
       
       黑籽重楼（Paris thibetica）主要分布于西藏南部、云南西北部至西部, 四川西半部至峨眉山、甘肃南部、锡金、不丹也有。其下有黑籽重楼原变种(P. thibetica var. thibetica) 与无瓣黑籽重楼(P. thibetica  var. apetala) 两个变种［1］。研究表明黑籽重楼有明显的镇静作用［4］，其富含的偏诺皂苷，是重楼的主要药效成分［1］。在滇重楼等利用过度的情况下［5］，对黑籽重楼进行种内分化和遗传多样性等研究，使其充分的了解种质资源，显得迫切并有必要。
       
       传统的形态标记是遗传标记的基础［6］，是检测遗传多样性和区分种属间差别最直接的方法。但形态特征的变异除与自身遗传基础的变异相关外，还与其所处的环境等因素相关，是对基因的间接反映，并且形态标记的结果在缺乏严密的生物统计学分析下，结论往往不够完善。随着分子生物学的发展，DNA分子标记由于具有直接分析遗传物质，与基因表达无关，信息量大和所需样品量小等优点，目前被普遍认为是评判遗传结构最好的方法。简单重复序列间标记(Inter-simple Sequence Repeat，ISSR)是一种基于微卫星序列发展起来的分子标记［7］, 具有简便、多态性高, 稳定性和重复性好等优点，在分类学、种系发生学、保护生物学和种群遗传学等方面得到迅速应用［6］。
       
       本实验通过形态差异分析结合数量统计方法对不同生境下黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼的14项形态特征进行测定和分析，观察黑籽重楼的种内形态分化的水平，以达到了解其遗传多样性水平的目的。并采用ISSR分子标记技术对同域生长的黑籽重楼种下的黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼进行分子水平的遗传分化的研究，寻找区别两变种的特征带。
       1  材料和方法
       1.1  材料用于形态分析的黑籽重楼共来自于10个居群，其中黑籽重楼原变种（Paris thibetica var. thibetica）分别来自于不同的7个居群，无瓣黑籽重楼(Paris thibetica var. apetala)分别来自于不同的3个居群（见表1）。表1  形态分析材料（略）
       
       用于ISSR分析的黑籽重楼原变种（Paris thibetica var. thibetica）和无瓣黑籽重楼(Paris thibetica var. apetala)均采集于四川彭州龙门山（海拔2 560 m），各变种各取3株，叶片均用硅胶干燥。凭证标本藏于四川大学生命科学学院植物标本室。
       1.2  方法
       1.2.1  形态指标测量及相关数据分析选取10个居群的黑籽重楼的14个形态学指标进行测定。用SPSS 13. 0软件计算各形态学指标的平均值（X）、标准差（δ）、单因素方差分析、使用NTSYS-PC2.10进行主成分分析［8］。
       1.2.2  基因组DNA提取基因组DNA提取采用CTAB法［9］，提取的黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼基因组DNA分别为各变种的3个个体的混合样。通过1%的琼脂糖电泳检测DNA质量，-20℃保存备用。
       1.2.3  ISSR-PCR扩增ISSR-PCR扩增体系为20 μl的PCR反应液。其中包括:10×buffer 2.5 μl，Mg2+ 2 μl (2mmol/L)，dNTP 2 μl( 0.12 mmol/L)，ISSR 引物2 μl (1 μmol)，Taq 酶0.5 μl( 1.5 U)，模板 2 μl( 50～100 ng)，超纯水9.5 μl。Taq酶，dNTP 和均购自Takara公司，ISSR引物序列由从加拿大哥伦比亚大学（UBC）提供。
       
       PCR反应程序为94 ℃5 min，1个循环；94 ℃30 s，36 ℃60 s，72 ℃90 s，40 个循环；最后72 ℃延伸5 min。扩增产物以Takara公司100 bp DNAladder为分子标记，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结束后用EB染色，并用GeneGenius BioImaging System凝胶成像仪上成像观察。
       2  结果与分析
       2.1  居群间形态变异对于来自于10个居群的黑籽重楼（黑籽重楼原变种7个居群，无瓣黑籽重楼3个居群）的14项形态特征进行统计分析（见表2），7个黑籽重楼原变种在居群间水平上，在除了叶片长、萼片宽的12个性状的差异极显著。3个无瓣黑籽重楼在居群间水平上，叶柄长、花药数、花丝长、花药长、萼片数5个形状的差异显著。表2  居群间形态性状的单因素方差分析（略）
       2.2  变种间形态差异为探讨变种间的形态差异，采用单因素方差分析对两变种的各形态指标进行了分析（见表3），14个形态特征中，两个变种在花药数、花丝长、花药长、花瓣数、花瓣长5个花器官性状方面的差异达到极显著，在萼片长和宽上有显著差异。表3  两变种具有显著性差异的7个形态性状的单因素方差分析（略）
       2.3  各形态学指标的主成分分析为进一步探讨两变种在形态上的分化式样，对71个个体进行了形态特征的主成分分析（见图1）。前3个主成分的累积方差贡献率为86.43%，选取前2个主成分为黑籽重楼及其变种的综合性状的重要主成分（见表4）。其中主成分1主要代表了株高、叶片长、叶片宽等营养器官的特征，主成分2主要代表了花药数、花丝长、萼片数、萼片宽、花瓣数、花瓣长等花器官的特征、叶片数等性状，主成分3主要代表花药长。虽然主成分分析图（见图 1 ）中变种间及变种内交叉的现象较明显，不能明确区分两变种。但也有一定的聚类趋向，如主成分二轴上，无瓣黑籽重楼个体主要均散布于下半部分。另外，分布较近的居群趋于聚合在一起，如峨眉山太子坪和洗象池两个居群（椭圆区域内）。表4  黑籽重楼两变种形态特征主因子载荷矩阵（略）
       2.4  两变种的ISSR分析为探讨两变种在DNA水平上的差异，对两变种进行了ISSR-PCR 扩增（见图2）。从100个序列引物中筛选出8个扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物 (见表5)。统计100 bp-1 500 bp之间的清晰可见带，共扩增出 36条带,其中多态性带13条，占总条带数的36.11% 。每个引物扩增出DNA带数3～8 条,平均4.5 条,多态性带平均1.625 条。黑籽重楼原变种扩增出28条带，其中多态性带有5条，其中两条片段长度为800 bp，另外3条片段长度分别为400 bp，550 bp，和1200 bp。无瓣黑籽重楼扩增出32条带，其中多态性带有8条，其中两条片段长度为750 bp，还有两条片段长度为600 bp，另外4条片段长度分别为380 bp，400 bp，580 bp，和1 300 bp。表5  筛选出的8个ISSR随机引物及扩增条带统计（略）
       3  讨论
          
       重楼属植物种类繁多,化学成分复杂, 药理活性强, 临床应用范围广。重楼属植物不同种的某些外部形态特征较相似, 容易混淆, 使得药用品质不一; 某些种形态变异较大, 表现出较大的多样性。加上自然和人为的因素，对重楼属植物相关的物种遗传背景研究的缺乏, 这些都将给重楼的繁殖以及产业化发展带来较大的影响［10］。黑籽重楼种内分化和遗传多样性等研究不仅对重楼属植物的系统划分有重要意义，还在滇重楼等利用过度的情况下，充分了解和更好地利用其他重楼种质资源上具有积极的现实意义。
       3.1  黑籽重楼居群间分化通过形态指标的单因素方差分析表明: 黑籽重楼的各形态特征在不同居群之间都有一定程度的变异，叶柄长、叶片数、叶片宽、株高、花药数、花丝长、花药长、萼片数等性状均呈极显著性差异，即黑籽重楼种内居群间的形态变异水平较高。黑籽重楼原变种居群间的形态特征变异程度接近整个黑籽重楼居群间的水平，而无瓣黑籽重楼居群间的差异主要表现在花药数、花丝长、花药长、萼片数，并且差异只呈显著性差异，表明黑籽重楼原变种的形态多样性高于无瓣黑籽重楼，与唐铭霞等［11］得出的黑籽重楼原变种遗传多样性高于无瓣黑籽重楼的结论相吻合。
       
       由主成分分析结果可知,黑籽重楼的形态特征在整体水平上表现为居群间无规律性，在同一居群的多数个体常能聚在一起，但也有不同居群个体聚集的现象。比如云南中甸下久洛和云南丽江玉龙山乌头地的两个居群个体聚集，可能是由于这两组居群所处地点的生境相似，相似的环境因素同一物种的形态分化较小，且黑籽重楼各居群间基因流较大（Nm=1.6870）［11］，可以一定程度抵御遗传漂变引起的居群分化［12］，故遗传一致度较高。
       3.2  黑籽重楼变种间分化黑籽重楼两变种的形态特征经过单因素方差分析表明初步的形态分类不能达到完全区别这两个变种的目的。但两变种在花药数、花丝长、花药长、花瓣数、花瓣长这5个花器官性状上均有极显著性差异，能从这些形态差别上区分两个变种。两变种的主要差异还是体现在花器官上，特别是花瓣数目上。云南彝良朝天麻地区的无瓣黑籽重楼与黑籽重楼原变种形态标记主成分分析出现了部分聚集的现象。黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼之间具有一定的进化关系，存在很近的亲缘关系，特别是同域生长的这两个变种。
       
       在黑籽重楼的种下遗传分化研究方面，主要是通过摸索黑籽重楼ISSR的条件，找出黑籽重楼两变种的特征带。本实验选取四川彭州龙门山的黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼进行ISSR分析，是由于黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼本就是在同一生境混生的两个变种［1］。而同域生长的两变种的基因交流可能是很频繁的，比如云南彝良朝天麻地区的黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼这两变种个体就聚集在一起。黑籽重楼两变种在形态分化的显著性差异主要是集中在几个花器官形态特征上，而表型是由遗传和环境因素共同决定的，选用同域生长的黑籽重楼两变种，排除了环境因素的影响。而通过形态差异分析得到两变种主要在花器官特征上存在显著性差异，说明两变种的遗传差异主要造成的是花器官的差异。至于通过ISSR所得的13条差异带，究竟是由哪些基因控制以及它们之间的相互关系，还有待进一步的研究分析。
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