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       【摘要】 
       目的观察支配耳甲区迷走神经在延髓水平中枢的投射情况，探讨耳针作用机理。方法健康成年SD大鼠10只，外耳道口方向分离耳甲皮肤与皮下组织，微量注射器缝内注射40 μl 浓度为30%的HRP神经示踪剂，神经示踪技术观察标记细胞在延脑水平核团分布情况。结果除了在三叉神经脊束核外，在孤束核和迷走神经运动背核以及其他核团也发现了标记神经元或神经纤维。结论耳甲区迷走神经分支与迷走初级中枢有神经联系，耳甲穴位针刺效应很可能是通过耳-迷走反射途径实现的。
       【关键词】  耳针； 孤束核； 迷走神经运动背核； 辣根过氧化物酶
       Morphological Basis of Auricular Acupuncture Effects: Evidences from Neural Tracer Method of HRP
       MEI Zhigang, ZHU Bing, HE Wei, GAO Xinyan
       （Medical College of China Three Gorges University, Yichang 443002, China; Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700,China）
       Abstract：ObjectiveTo observe projections of nervus auricularis vagi in brain stem of oblongata level，and to study the mechanism of auricular acupuncture. MethodsTen SD rats were used in this experiment, a skin incision was performed in the region of auricular concha of each rat, forty microliters of a 30% solution of horseradish peroxidase (HRP) in normal saline were subcutaneously injected into the cut central end of auricular branch of vagus nerve, then distribution of the labeled neurons in the primary brain stem was observed using HRP retrograde tracing technique. ResultsLabeled neurons and fibers were seen in the nucleus of solitary tract, dorsal nucleus of vagus nerve and other nucleus besides nucleus of spinal tract of trigeminal. ConclusionThere exists neural projection to NTS and DMV from the terminal of auricular vagus branch, maybe effect of auricular acupuncture is completed through auricular-vagal reflexes.
       Key words：Auricular acupuncture;   Nucleus of solitary tract;   Dorsal nucleus of vagus nerve;   Horseradish peroxidase (HRP)
       
       “耳为宗脉之所聚”，耳穴特别是耳甲区穴位刺激作为针灸诊疗学的一个分支的应用受到古今中外临床医生的青睐，其适应证多为高血压病、糖尿病、癫痫、失眠等病［1］。自从1957年法国外科学博士Nogier发现耳穴的坐骨神经点与第4腰椎骨有解剖学联系，并在此基础上提出了著名的“倒置胎儿图”［2］，较多的学者对耳疗作用机制进行了研究。近年来，有关耳针机制的研究报道零星可见，然而截至目前耳疗（特别是耳甲区穴位刺激）的机制尚不明了，缺乏系统的理论阐释［3，4］，耳穴的信息传入中枢机制尚有待探讨。笔者新近电生理实验观察到耳甲区穴位电针能够激活延髓孤束核处葡萄糖敏感神经元（抑制反应型为主）和胰岛素敏感神经元（激活反应型为主）［5］，据此，我们初步认为耳穴作用机制可能与“耳-迷走反射”有关。本研究采用辣根过氧化物酶（HRP）神经示踪法，探讨耳迷走神经分支在延髓水平的投射情况，为“耳-迷走反射”理论假说提供形态学佐证。
       1  材料与方法
       1.1  实验动物及耳甲区HRP微量注射200～250 g的健康成年SD大鼠10只，雌雄不拘，中国医学科学院实验动物中心提供，清洁级，合格证编号：A06-53。动物在12 h光照／12 h黑暗的条件下单笼喂养一周，并给予自由饮水及进食。
        
       经2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)后，在大鼠耳甲部用手术刀片横向划开一条长约2 mm缝口，向外耳道口方向分离缝内耳甲皮肤与皮下组织，微量注射器针头向分离后的缝内注射40 μl HRP（30%，RZ=3.2，Sigma），注射完毕，退针后，紧按缝口3～5 min，每只大鼠两耳各注射3～5个点，注射点尽量分布于整个耳甲艇和耳甲腔。实验过程中严格遵守美国国立卫生院实验动物福利法规定。
       1.2 HRP 组化及四甲基联苯胺（TMB）法显色HRP注射后动物存活36～48 h，经2%戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉(30 mg/kg)后，于升主动脉依次注射冷生理盐水(4℃) 350 ml，1.25%戊二醛和1%多聚甲醛的磷酸缓冲液（pH=7.4）500 ml。灌流固定后，取延髓（闩上下2～3 cm）部位置于30％的蔗糖磷酸缓冲液中，4℃冰箱保存过夜，脱水至组织沉底。次日冰冻切片，片厚30μm，裱于挂胶载玻片上风干以待四甲基联苯胺(TMB) 进行呈色反应。
        
       孵育液配置方法：溶液甲：硝普钠 180 mg，双蒸水 185 ml，醋酸缓冲液 10 ml ( pH 5.0～5.4 )；溶液乙：TMB 10 mg，无水乙醇 5 ml。临用前将甲、乙溶液混合。切片以双蒸水洗涤3次后，放入TMB孵育液中，避光孵育20 min后, 每100 ml孵育液中加入0.3%过氧化氢2 ml，避光再反应20 min，不时轻轻晃动，直到出现絮状反应，立即结束反应，以洗保液（95 ml蒸馏水加5 ml醋酸钠缓冲液，pH=3.3）洗片 3 次后，经乙醇梯度脱水后，二甲苯透明，树脂封片，LEICA显微镜成像系统（DM IRB+Q500IM）下观察阳性标记的细胞情况，并摄像。
       2 结果
           
       除了在三叉神经脊束核（见图1）发现了标记细胞外，在孤束核和迷走神经运动背核也发现了标记神经元或神经纤维，但孤束核与迷走神经运动背核处标记的细胞数没有三叉脊束核标记多。其中孤束核处标记细胞多呈圆形，其胞浆充满了蓝黑色的颗粒，围绕细胞核的周围，其直径约20 μm；迷走神经运动背核处标记细胞多为菱形，细胞大小较迷走神经运动背核处标记细胞大，神经元突触标记明显，并且可见阳性纤维存在，标记神经元直径大约30～40 μm（见图2）。此外在疑核（图3）以及腹外侧网状核（图4）等处也发现了阳性标记细胞，细胞呈圆形或菱形，直径大小约20～30 μm。各核团标记细胞情况见表1。表1  耳甲区注射HRP延脑水平不同核团标记细胞情况（略）
       3  讨论 
           
       耳廓的神经支配丰富，来源较多。有研究显示耳廓部有来自脊神经颈丛的耳大神经和枕小神经，有来自脑神经的耳颞神经，面神经、舌咽神经、迷走神经的分支，以及随颈外动脉而来的交感神经［6～8］。上述神经在耳廓皮肤分布具有下述两个特点：①各神经之间有丰富的吻合支；②各神经分支区位分布有部分重叠性，构成了神经网状结构，如耳甲神经丛和三角窝神经丛具有多重神经支配。正因为此，故有学者认为，耳穴的作用不是单纯某一分支神经支配所起作用，而是支配某一区域的整个神经网络共同发挥作用使然［9］。然而，耳穴作用机制中到底哪个神经支配的作用占主导地位呢？一直以来，众多学者莫衷一是，有的认为与支配耳甲区的迷走神经有关，也有的认为与支配耳廓的交感神经相关。许瑞征等人20世纪70年代末综述了65篇针灸文献，根据耳廓不同解剖结构的神经分布情况不同统计了具有治疗内脏疾患功能的穴位百分率，比较了迷走神经分布区与非迷走神经分布区耳穴（穴区）的功效，如表2所示，耳甲艇耳甲腔具有治疗内脏疾患功能的穴位数和百分比均占首位，说明内脏在耳廓上的反射点和迷走神经耳支的分布区较为密切，但除了耳甲腔和耳甲艇外，耳廓其他部位亦具有一定内脏反射作用。表2  耳廓不同部位神经支配情况及具有内脏功能穴位百分率（略）
       根据上述临床统计结果不难看出耳穴调控内脏功能作用机制主要与耳迷走分支关系密切。耳穴是如何通过“耳-迷走反射”调控内脏功能的呢？笔者推测，与内脏功能密切相关的延髓可能参与了这一反射过程。
        
       较多的形态学实验业已证明耳穴与三叉神经脊束核有神经纤维联系，而对耳迷走神经分支的其他中枢（特别是孤束核和迷走神经背核）投射的研究报道较为少见［10］，本实验在大鼠耳甲部注射HRP于大鼠孤束核和迷走运动背核处明确观察到了标记细胞，从细胞的形态学分析细胞的类型当属于运动神经元和感觉神经元，这较好地解释了耳穴刺激对内脏功能具有调节功能。本结果与张诗兴，张启兵等［11，12］研究结果部分吻合，他们耳甲部穴位皮下注射HRP， 酶标细胞出现最多的神经节是交感神经节、颈前神经节和迷走神经节（结状神经节），而于耳轮部穴位皮下注射HPR，酶标细胞出现最多的神经节是三叉神经节、脊神经节和交感神经节；并且他们认为被标记的交感神经节内多极神经元很可能是体表（耳穴）-内脏相关联的重要途径。上述推断却与日本学者Sakashi早期研究相悖，研究小组在猫的迷走神经耳支末梢注射HRP，在颈静脉神经节、孤束核的间隙、背侧、背外侧、联合亚核、三叉神经脊束核、楔状核等发现有大量的标记细胞［13］，他们推测迷走神经耳支可能与孤束核有单突触神经联系，孤束核接受迷走神经耳支的传入继则与脊髓及脑干的躯体运功和躯体感觉中枢发生轴突联系，很可能是耳迷走神经与内脏功能相关联的重要机制。本实验结果同样证实了耳甲区迷走神经耳支投射至孤束核及迷走神经背核，与高昕妍等（中国中医科学院针灸研究所2005届博士毕业论文《耳针疗法与耳-迷走-内脏反射》）在耳甲部运用生物胞素及伪狂犬病毒示踪术观察结果基本相同，这可能是耳针具有内脏调节效应的最主要的形态学基础。
        
       “耳-迷走反射”理论是中国中医科学院针灸研究所朱兵研究员近年来提出的，用以解释体表穴位与内脏功能联系的主要学说之一［14］。高昕妍（Gao XY）［15］等新近研究进一步表明，耳部不同区域具有不同的生理功能与治疗效应，耳甲腔部穴位刺激能够引起较强的降压效应，而在外耳轮各部位针刺则未见明显的降压效果，此外，外耳轮尖部和尾部以及耳甲部穴位刺激均能够使胃内压升高；实验结果表明耳部穴位刺激能够引起不同效应的功能反射，这些反射的结果与耳部区域的不同神经支配有关。
        
       综上所述，耳甲区穴位刺激效应机制很可能是由耳-迷走反射介导的结果，本研究提示耳甲部迷走神经末梢除了在三叉神经脊束核投射外，还在重要的初级中枢孤束核、迷走神经运动背核及其他多个核团均有投射，这很可能是耳针作用复杂机制的主要形态学基础。
        
       致谢：本实验得到了中国中医科学院针灸研究所景向红博士、蔡虹高级实验师的帮助，在此谨表谢忱。
       【参考文献】
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