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       【摘要】 
       目的研究大鼠口服清脑宣窍方有效部位后进入脑组织的清脑宣窍方移行成分。方法大鼠脑样品取出，洗去残血、匀浆、甲醇提取、离心后水溶，用C18固相萃取柱处理，选用色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Eclipse XDB-C18 保护柱。建立大鼠口服清脑宣窍方有效部位后脑组织的LC-MS指纹图谱，并结合前期已分得的单体，对脑组织中移行成分进行了指认。结果确定了清脑宣窍方有效部位的靶器官脑的18个移行成分。结论清脑宣窍方栀子与三七的指标性有效成分栀子苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1均能进入脑，发挥作用。
       【关键词】  清脑宣窍方； 指纹图谱； 体内化学成分； 液相-质谱联用法； 脑
       Research on Chemical Constituents in Rat Brain after Taking Qingnaoxuanqiao Formula
       ZHOU Wei,SHI Renbing,SUN Jianning
       （Medical College,Wuhan Polytechnic Universtiy,Wuhan,Hubei 430023,China;School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100102）
       Abstract：ObjectiveTo research on the new constituents in brain after rats taking effective fraction of Qingnaoxuanqiao formula orally. MethodsThe rat brain samples were taken out, cleaned remaining blood, smashed into plasm , extracted by MeOH, and dissolved by water after centrifuging. A column of C18 solid phase was used for the extraction. The procedure was carried out on a chromatography column of Agilent Eclipse XDB-C18 chromatography column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) and a protective column of Eclipse XDB-C18. Established LC-MS fingerprint of brain of rat after rats taking effective fraction of Qingnaoxuanqiao formula orally, and confirmed the constituents，using the monomer got previously. ResultsConfirmed 18 main fingerprint peaks in target tissue: brain. ConclusionThe indicative effective constituents of Qingnaoxuanqiao effective fraction: geniposide, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 and notoginsenoside R1 can be found in the target tissue: brain and exert pharmacology effection.
       Key words： Qingnaoxuanqiao formula；  Fingerprint；   Inner-body chemistry；   LC-MS；  Brain tissue
       
       清脑宣窍方为王永炎院士救治脑中风临床经验方，由栀子、三七等中药组成。本方及其有效部位具有清热解毒、宣窍活络的作用，对于缺血性脑中风具有显著的疗效［1，2］；脑组织为其目标脏器之一。运用现代分析技术，在中药化学成分研究的基础上，研究大鼠口服清脑宣窍方有效组分后脑组织中存在的药物原型成分或代谢产物，有助于确定中药有效成分和作用机理研究。
       1  器材
           
       Waters 2695高效液相色谱仪，2696PDA检测器，自动进样；1100LC-MSD-Trap-XCT/Plus型液质联用仪 （美国Agilent公司）；Sartorious BT 25S型1/100000电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；QL-901漩涡混和机（其林贝尔仪器制造公司）；台式高速离心机（军事医学科学院实验仪器厂），匀浆机。
        
       栀子苷，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1及三七皂苷R1对照品均购自中国药品生物制品检定所（批号分别为：110749-200309，110703-200322，110745-200312，110704-200318）；人参皂苷Re，Galioside，6α－Hydroxygeniposide，3,3",5,5"-四甲氧基-4,4"-二-β-D-葡萄糖双环氧木脂素，6″－对香豆酰龙胆京尼平双糖苷，藏红花酸-1-葡萄糖(6-1)葡萄糖苷，京尼平龙胆双糖苷，2α,3β,19α,23-四羟基齐墩果-12-烯-28-酸，人参皂苷Rb2，Rb3，Rh1、Rf，Rc，Rg2，Rg3，Rd及三七皂苷fa，R4，R7及 F2对照品由北京中医药大学石任兵教授课题组提供。
        
       乙腈（Fisher公司），色谱纯；屈臣氏重蒸水（液相用水）；Milli-Q系统纯化水（液质用水）；肝素、水合氯醛及甲酸为分析纯，均购自北京北化精细化学品有限责任公司。Cleanert C18 SPE固相萃取柱（3 ml，200 mg，60 μm，北京艾杰尔科技有限公司）
        
       实验对象：SD大鼠：体重(300±10)g，雄鼠［北京市维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号：SCXK(京)2007－0001］。
       2  方法
       2.1  给药剂量及脑组织处理方法单剂量灌服清脑宣窍有效部位(6.0 g/kg)；灌服清脑宣窍有效部位后1 h取出大脑，吸干水分，精密称重，加入脑重量两倍体积的生理盐水。以18 000 r/min匀浆，匀浆液加入两倍体积的分析甲醇,涡旋振荡10 min,混合液在6 000 r/min下离心20 min,取出上清液。残渣再加入两倍体积甲醇涡旋振荡10 min, 6 000 r/min下离心20 min,两次上清液混合,常温减压回收至干。残渣用5 ml液相水溶解，超声振荡，上SPE固相萃取柱，先用水洗脱3 ml，再用甲醇洗脱2 ml，收集甲醇洗脱液，常温减压干燥，残渣加甲醇300 μl 漩涡溶解，即得供试品溶液。
       2.2  HPLC-MS条件色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6   mm×250 mm，5 μm)；保护柱：Eclipse XDB-C18；柱温：30℃；流速：1.0 ml /min；检测波长：203，238nm；乙腈（A）-酸水（B）二元梯度洗脱,梯度为：5%A17 min  →16%A23 min  →16%A28 min  →20%A34 min  →22%A50 min  →30%A65 min  →45%A80 min  →100%A。1100LC-MSD-Trap-XCT/Plus型液质联用仪：质谱（MS）条件：ESI离子源；离子源温度350℃；毛细管电压：3 000 eV；负离子检出模式；雾化气压力：60 psi；干燥气：N2；流速：12 L/min；扫描范围：200～1 800 m/z。
       3  结果
           
       脑供试品液10 μl进样。实验结果图谱见图1～4及表1。表1  口服清脑宣窍有效部位后脑移行成分的色谱峰的时间、结构信息（略）
       4  讨论
           
       通过对口服清脑宣窍方有效部位后脑1 h图谱比较分析可知，能发现属于栀子及三七的体内移行成分共18个，其中有4个代谢成分。4个代谢成分中，8.4 min的成分和Galioside、6α－Hydroxygeniposide的碎片离子完全一样，可以推断其为Galioside和6α－Hydroxygeniposide的同分异构体；39.7 min的成分和6″－对香豆酰龙胆京尼平双糖苷的碎片离子完全一样，也推测为同分异构体；另48.4 min的未知成分可能为三七中皂苷的代谢产物（脱去葡萄糖后），而67.2 min的未知成分推测结构可能为人参皂苷Re脱去葡萄糖后的代谢产物。
        
       栀子苷，人参皂苷Rg1，Rb1，三七皂苷R1为清脑宣窍方主要药效成分［3，4］，而心、脑为其主要靶器官。从试验结果可以看出，脑部除了有以上3种有效成分外，还包括栀子和三七的其他成分:其中栀子主要为环烯醚萜类成分，而三七主要为皂苷类成分。已有研究证明环烯醚萜类具有显著抗炎、抗脂质过氧化、抗血管生成、抗NO生成、抗淀粉β蛋白质的神经毒性等药效, 京尼平也是迄今为止所研究的环烯醚萜物质中抑制诱变剂诱变活性最强的物质［5］，而三七皂苷具有镇静，镇痛，益智，改善脑血循环，对实验性脑缺血的保护等作用［6］。传统中药研究与现代分析技术手段结合，是中药现代化的必须［7］。一个疗效确切的复方进入人体内的成分谱中多数成分是否存在对疾病的多靶点基因表达的调控作用，必须建立在确认该成分（代谢产物）在靶器官内是否存在的基础上，再进行体内外药效学研究。
       【参考文献】
         　　［1］韩振蕴，张允岭，石任兵，等. 清脑宣窍滴丸治疗急性期腔隙性脑梗死66例临床观察［J］. 辽宁中医杂志,2007,34(4)：433.
       
       ［2］柳洪胜，张允岭，刘雪梅，等.清脑宣窍滴丸对大鼠局灶脑缺血再灌注炎症因子含量的影响［J］. 中华中医药杂志，2007,22(5)：328.
       
       ［3］陈玉平，石任兵，刘 斌，等. HPLC法测定清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的含量 ［J］.北京中医药大学学报, 2007, 30(1):54.
       
       ［4］陈玉平，石任兵，刘 斌，等. RP-HPLC法测定清脑宣窍方有效部位中藏红花酸含量［J］. 北京中医药大学学报, 2004,27(3): 63.
       
       ［5］王永宏，苏 建，王健芳，等.栀子中京尼平苷的微生物转化研究［J］. 时珍国医国药, 2007, 18(12):3003.
       
       ［6］甘 雨，徐惠波，孙晓波，等.三七总皂苷的药理作用研究进展［J］. 时珍国医国药, 2007, 18(5):1251.
       
       ［7］季宇彬，彭海生，蓝苑元.血清化学的研究现状与展望［J］. 中草药，2003,34(4): 2.