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       【摘要】 
       目的观察麝香乌龙丸对兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡和凋亡调控基因bcl-2及其抑制基因bax的影响,探讨麝香乌龙丸对关节软骨的保护作用是否与抑制细胞凋亡与调节bcl-2及bax的表达有关。方法选用健康日本大耳白兔30只，随机分成正常对照组、造模组、麝香乌龙丸组。用1.6%木瓜蛋白酶膝关节腔内注射，建立兔膝骨关节炎模型， 4周后处死全部动物，取右膝关节胫骨内侧髁软骨，软骨组织切片用TUNEL法检测软骨细胞凋亡，免疫组化法检测关节软骨中bcl-2、bax的水平。结果麝香乌龙丸组细胞凋亡率明显低于造模组（P＜0.05），bcl-2在麝香乌龙丸组中的表达高于造模组（P＜0.05），bax的表达低于造模组（P＜0.05）。结论麝香乌龙丸通过上调bcl-2的表达，下调bax的表达，达到抑制兔实验性膝骨关节炎软骨中软骨细胞的过度凋亡，这可能是该药治疗骨性关节炎机制之一。
       【关键词】  麝香乌龙丸； 膝骨关节炎； 细胞凋亡
       The Effect of Shexiang-wulong Pill on the Rabbit Osteoarthritis Chondrocyte Apoptosis
       WANG Zhiwen, ZHAO Xin, BAO Jipeng, GU Ningfei, WANG Jiangang
       (The Affiliated Hospital of North China Coal Medical University,Tangshan 063000,China　North China Coal Medical University，Tangshan 063000, China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Shexiang-wulong pill on the rabbit knee osteoarthritis(KOA) chondrocyte apoptosis, apoptosis regulatory genes bcl-2 and its impact suppressor gene bax. To explore the relationship of Shexiang-wulong pill on the protective effect of articular cartilage with the inhibition of apoptosis and regulation bcl-2 and bax expression. Methods30 healthy male rabbits were randomly divided into three groups: A.normal control group, B.model group,C. Shexiang-wulong pill group. Make KOA models by injecting papain to the right knees of rabbits, after 4 weeks all animals were put to death.Then take the right knee medial tibial condyle cartilage. Cartilage tissue with cartilage TUNEL assay of apoptosis, detected by immunohistochemistry of articular cartilage in the bcl-2, bax level. ResultsThe rate of apoptosis of the group C was significantly lower than of B（P＜0.01）, the expression of bcl-2 in C was higher than that in B（P＜0.01）, the expression of bax in，the C was lower than in B (P＜0.01).ConclusionIt plays a role by upregulating the expression of bcl-2, reducing the expression of bax to inhibit the excessive apoptosis of chondrocytes on the rabbit KOA，this may be one mechanism of Shexiang-wulong pill on the treatment of KOA.
       Key words：Shexiang-wulong pill;  Knee Osteoarthritis;  Apoptosis
       
       麝香乌龙丸是通过挖掘整理宋代·许叔微《普济本事方》中“麝香圆”研制而成，具有温经通络、祛湿除痹、舒筋活络、消肿止痛之功效，临床上在缓解骨关节炎患者关节疼痛、消除关节肿胀、恢复关节功能等方面有显著的疗效。本课题通过建立兔实验性膝骨关节炎模型，经麝香乌龙丸治疗，采用TUNEL（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记）法检测软骨细胞凋亡，免疫组化法检测关节软骨中bcl-2、bax的水平，藉以探讨麝香乌龙丸治疗骨关节炎是否与抑制软骨细胞过度凋亡有关。
       1  材料与仪器
       1.1  药物麝香乌龙丸:华北煤炭医学院附属医院研制，由人工麝香、制川乌、地龙、全蝎、黑豆组成， 批准文号为冀药制字Z20051581。
       1.2  动物健康雄性日本大耳白兔30只，体重(2.5±0.15)g，于室温分笼饲养, 按顿供给标准饲料(由华北煤炭医学院实验动物中心提供)，自由活动、饮水。
       1.3  试剂及仪器TUNEL细胞凋亡试剂盒、bcl-2及bax免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司提供）,木瓜蛋白酶（活力200万单位，天津诺奥科技发展有限公司提供）。石蜡组织切片机（天津天利航空机电有限公司），光学显微镜BX50型（日本OLYMPUS公司生产）。
       2  方法
       2.1  动物分组健康雄性日本大耳白兔30只，适应性喂养1周后，将动物按体重由小到大编号，查随机数字表将大耳白兔分为正常组、造模组、麝香乌龙丸组，每组10只。
       2.2  模型建立参照日本鬼头康彦［1］等的兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节炎病变模型方法，用氯氨酮注射液肌肉注射（每公斤体重10 mg）将兔麻醉后，造模组和麝香乌头丸组均于右膝关节处剔毛，碘伏消毒，将关节轻弯，经髌腱内侧进针，关节腔内注射1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5 ml, 隔3 d注射1 次, 共注射3次。期间动物用标准饲料正常饲养。
       2.3  给药造模成功后第2天开始给药。麝香乌龙丸组按成人每日每千克体重用药量的6倍剂量作为大耳白兔每日每千克体重的等效剂量(麝香乌龙丸0.6 g/ kg)，溶于10 ml 生理盐水中灌胃，1次/d；正常组和造模组灌入等量生理盐水；灌胃4周。
       2.4  标本采集及处理于末次给药后24 h以气栓法处死动物，逐层切开膝关节，切取胫骨内侧髁软骨，10%中性福尔马林溶液固定后, 石蜡包埋，切片，用TUNEL法及免疫组织化学法检测。
       2.5  数据处理细胞凋亡及免疫组化结果均采用方差分析, 运用SPSS13.10 统计学软件进行分析。
       3  结果
       3.1  TUNEL法检测细胞凋亡凋亡结果判定切片中软骨细胞细胞核内呈现棕黄色颗粒者为阳性细胞。每张切片光镜下计数10个400×视野，以平均100个细胞核中含凋亡细胞个数作为凋亡率。凋亡率（%）=凋亡细胞数/细胞总数×100%。结果见表1。表1  麝香乌龙丸对软骨细胞凋亡率的影响（略）
       3.2  软骨bcl-2，bax免疫组化染色结果判定切片软骨中软骨细胞胞浆呈棕黄色染色为阳性细胞。阳性率计算:每张切片光镜下计数10个400×视野，根据阳性细胞占视野中细胞总数比例计算出阳性率。阳性率（%）=阳性细胞数/细胞总数×100%。结果见表2。
       4  讨论
           
       骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种慢性、渐进性、退行性的关节病变。骨性关节炎在所有关节炎中是最常见的，随着年龄的增长，患病率逐渐增加，严重影响着中老年人的健康和生活质量。骨性关节炎的病因及发病机制目前尚不明确，其基本病理改变为多种致病因素引起的进行性关节软骨变性、破坏及丧失。近年来的研究显示，软骨细胞的过度凋亡可能是OA发病的重要原因［2］，因此抑制软骨细胞凋亡成为防治骨性关节炎的重要途径。软骨细胞凋亡的调控途径，目前研究较多的是Fas途径和NO途径，对于bcl-2基因家族的研究相对较少。表2  麝香乌龙丸对软骨细胞bcl-2、bax阳性率的影响（略）
       
       细胞凋亡是一个正常的生理过程，是一种由基因调控的主动地去除非需要或损伤细胞的程序性死亡过程，然而过度凋亡则是病理性的。TUNEL技术在原位对凋亡的软骨细胞检测发现OA病人的软骨细胞凋亡明显高于正常人［3］。软骨细胞凋亡是受凋亡相关癌基因调控的。bcl-2基因家族是细胞凋亡的重要调控基因，在细胞凋亡的过程中处于调控机制的终末部分，该基因家族在维持细胞生理性分化发育和细胞数量的动态平衡中具有重要作用。其中bcl-2基因所编码的bcl-2蛋白，能阻止多种因素诱导的凋亡。而bax是与bcl-2作用相互拮抗的基因，它们结构上具有一定同源性，可相互结合形成二聚体。bcl-2的过量表达时，形成bcl-2同源二聚体，能抑制细胞凋亡，细胞受到保护［4］;而bax的过度表达，则可以与bcl-2形成异源二聚体，拮抗bcl-2抑细胞凋亡的作用［5］，那么细胞就走向凋亡。
        
       骨性关节炎属于中医“骨痹”“痛痹”等范畴，其发病与年老肝肾亏虚、外感风寒湿邪密切相关，最终导致关节气血、痰瘀凝滞而发病。《内经》说：“风寒湿三气杂至，合而为痹”；《证治准绳》云：“（膝痛）有风、有寒、有闪挫、有瘀血、有痰积，皆实也，肾虚其本也。”麝香乌龙丸由麝香、制川乌、地龙、全蝎、黑豆组成。本方君以麝香行血通络，消肿止痛，辅以川乌温阳散寒，驱风逐湿为臣，地龙善通经络，能引川乌直达风寒湿邪所结之处；全蝎息风解痉止痛，并与地龙相伍搜剔窜透，共为佐药；黑豆健脾益肾，有治风湿痹痛之效，并解诸药之毒，以为使药。全方配伍恰切骨痹寒、瘀、虚病机，组方有理有序，药简而力专，临床治疗膝骨关节炎疗效满意。
        
       本研究结果表明，麝香乌龙丸能抑制软骨细胞过度凋亡，增加抑制凋亡因子bcl-2的表达，降低促进凋亡因子bax的表达，从而达到缓解骨关节炎患者关节疼痛、消除关节肿胀、恢复关节功能、改善关节炎软骨的退行性改变的作用。由此可认为麝香乌龙丸治疗膝骨关节炎有效可能与减少细胞过度凋亡，调节bcl-2、bax的表达有关。
       【参考文献】
         　［1］Oltariz，Milliman C，Korsmeyer ST.Bcl-2 heterodimers in vivo with a conserved homolog，bax，that accelerates programmed cell death［J］.Cell，1993，74：609.
       
       ［2］Kim H,Lo M,Pillarisetty R.Chondrocyte apoptosis following intraarticular fracture in humans［J］.Osteoarthritis Cartilage,2002,10(9):747.
       
       ［3］Hashimoto S，Takahashi K，Amiel D，et al.Chondrocyte apoptosis and nitric oxide production during experimentally induced osteoarthritis［J］.Arthritis Rheum，1998，41（7）：1266.
       
       ［4］Yin XM,Oltvai ZN,Koesmeyer SJ.BH1 and BH2 domains of Bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with Bax［J］.Natuer,1994,369(6478):321.
       
       ［5］Chen CJ,Chen FC,Liao SL,et al.Effects of naloxone on lactate pyruvate metabolism and antioxidant enzyme activity in rat cerebral I/RJ［J］.Neurosci lett,2000,287(2):113.