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       【摘要】 
       目的研究桑白皮黄酮平喘作用。方法采用小鼠离体肺支气管灌流法，考察药物离体条件下拮抗乙酰胆碱的作用；采用豚鼠组胺和乙酰胆碱雾化引喘模型、豚鼠卵蛋白引喘模型，以引喘潜伏期、血浆血栓素B2（TXB2）和6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）含量为评价指标，并对哮喘豚鼠肺组织进行病理检查，研究桑白皮黄酮的平喘作用。结果桑白皮黄酮拮抗乙酰胆碱对小鼠肺支气管的收缩作用，延长组胺、乙酰胆碱引喘潜伏期和豚鼠卵蛋白性哮喘潜伏期，降低哮喘豚鼠嗜酸性粒细胞(EOS)的浸润，但对哮喘豚鼠血浆中TXB2和6-keto-PGF1α水平的影响未统计出显著性。结论桑白皮黄酮具有一定平喘作用。
       【关键词】  桑白皮； 黄酮； 平喘
       Antiasthmatic Effects of the Flavonoid of Cortex Mori
       WEI Yuanyuan, XU Feng, CHEN Xiaowei, CHEN Xia, ZHANG Guogang
       (Department of Biological and Chemical Engineering, Guangxi University of Technology, Liuzhou, Guangxi 545006, China;  School of  Pharmacology, Shenyang Pharmacological University, Shenyang 110016, China; School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmacological University, Shenyang 110016, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the antiasthmatic effects of the flavonoid of Cortex Mori (FCM).MethodsThe effect of FCM against acetylcholine was examined with bronchotracheal perfusion in mice in vitro. Histamine-acetylcholine and ovalbumin were used to induce the asthma model in guinea pigs, respectively, and some other indices were investigated including the latency of asthma, the content of TXB2 and 6-keto -PGF1α in the blood plasma.The lungs of guinea pigs were harvested, hematoxylin and eosin (HE)-stained, and the infiltration of eosinophiles (EOS) was examined under microscope.ResultsThe contractive effect of acetylcholine on bronchus was inhibited by FCM in vitro. The latency of asthma induced by histamine-acetylcholine and ovalbumin in mice was significantly prolonged by FCM. The number of EOS in lung of asthmatic guinea pigs was decreased by FCM. However, the content of TXB2 and 6-keto-PGF1α in the blood plasma had no significant change in asthmatic guinea-pigs.ConclusionFCM has antiasthmatic effect.
       Key words：Cortex Mori;  Flavonoid;  Antiasthmatic effect
       
       桑白皮(Cortex Mori)为桑科落叶灌木或小乔木植物Morus alba L.除去粗皮的干燥根皮，具有泻肺平喘、利尿消肿等功效。有报道桑白皮平喘作用与其中含有的香豆素类化合物（东莨菪内酯）［1］和丙酮提取物［2］有关。桑白皮中黄酮化合物含量较大，且近年来分离得到了多种化学成分［3］，但桑白皮黄酮的平喘作用研究较少。鉴于黄酮类物质具有多种生理活性，本实验对分离提纯得到的桑白皮总黄酮的平喘作用进行探索。
       1  材料与仪器
       1.1  受试物及试剂桑白皮总黄酮（FCM）：含桑色醇（含量为 20 %）、桑根酮、桑皮素等黄酮类化合物的提取物，棕色干燥粉末，由沈阳药科大学天然药物化学教研室提取［4］；磷酸组胺(His)：上海丽珠东风生物技术有限公司；氯化乙酰胆碱(Ach)：上海三爱思试剂有限公司；蛋白片：天津市东方卫生材料厂；TXB2和6-keto-PGF1α放射免疫试剂盒，南京建成生物研究所；其余试剂为分析纯。
       1.2  动物豚鼠，动物使用许可证SYXK(辽)［2003］0012号；昆明种小鼠6～7周龄，动物合格证为SCYK(辽)［2003］0008号。均为沈阳药科大学动物室提供。
       1.3  仪器亚都医用雾化治疗器Yc-Y800，亚都科学技术股份有限公司；FMJ全自动放射免疫r-计数器，上海市检测技术所上立检测仪器厂。
       2  方法与结果
       2.1  统计计量资料的组间比较用t检验统计，计数资料显著性用Fisher确切概率法统计。
       2.2  小鼠肺支气管灌流实验小鼠，25～30 g雌雄不限，颈椎脱臼处死后，取出气管与肺，置于盛有(37±1)℃ 的含氧邵氏液的培养皿内，剥离多余组织，将气管套在恒压灌流装置的套管上，参照文献方法［5］进行恒压灌流。待流量恒定后，加入10-4 g/ml Ach 0.1 ml使气道收缩，固定流量通过气道的时间延长，记录10 ml灌流液流出时间（t0）。待恢复流量恒定后，加入不同浓度的受试药物0.1 ml (空白对照加入等体积邵氏液)，然后立即加入上述浓度 Ach 0.1 ml，同法记录10 ml灌流液流出的时间（t1），并计算药物拮抗率(%) =t0-t1t0×100%。结果见表1。FCM具有明显对抗乙酰胆碱收缩而缩短肺支气管灌流固定流出量的时间。表1  桑白皮黄酮对小鼠肺支气管灌流的影响（略）
       2.3  对豚鼠His和Ach引喘的影响豚鼠(体质量< 200 g)，逐个放入喷雾箱内，用超声雾化仪喷入2.0% Ach和0.1% His混合液10 s，挑选引喘潜伏期(从喷雾到哮喘发作，呼吸极度困难，直至抽搐跌倒的时间)在150 s内的合格豚鼠，大于150 s的不选用。次日挑选合格的豚鼠60只，雌雄各半，随机分成6组，10只/组，实验组分别i.g FCM 37.5 ，75，150，300 mg/kg，阳性对照组i.g.氨茶碱100 mg/kg组，空白对照组给予等体积的蒸馏水。上述各组连续给药4 d，于末次给药后40 min将豚鼠逐个放入玻璃钟罩内，同筛选条件进行喷雾，记录豚鼠的引喘潜伏期和抽搐动物数，大于360 s不跌倒者按360 s计算。吸入的His、Ach作用于豚鼠气道上的H1、M受体造成支气管收缩，使动物呼吸困难，此模型可以模拟哮喘呼吸道阻塞症状。结果见表2。FCM低剂量组未统计出显著性差异，而其它FCM给药各组引喘潜伏期显著延长，最大可延长51.3％，但抽搐的动物数并无统计学差异（P >0.05）。同时哮喘潜伏期实验结果提示，150 mg/kg的剂量反应的药效已经接近最大值，再增加剂量药效不会相应增大。表2  桑白皮黄酮对His、Ach所致哮喘豚鼠引喘潜伏期的影响（略）
       2.4  豚鼠卵蛋白哮喘实验豚鼠30只，随机分成6组，5只/组，分别为对照组,模型组,FCM低、中、高剂量组，地塞米松组。给药各组每只动物于两后腿 i.m. 5 % 蛋白片生理盐水0.3 ml，并同时i.p. 5 % 蛋白片生理盐水2 ml致敏，对照组给同体积生理盐水。致敏10 d后给药，对照组、模型组ig给等体积的蒸馏水，FCM组分别i.g. 37.5，75，150 mg/kg，地塞米松组i.m.10 mg/kg。致敏14 d后对照组雾化吸入生理盐水，其他组用1 % 蛋白超声雾化吸入诱发哮喘。记录豚鼠10 min内出现Ⅱ级哮喘（呼吸困难和咳嗽反应）的潜伏期作为统计指标。之后，隔日喷雾反复诱发哮喘，并继续给药。5 d后乌拉坦麻醉，取5 ml注射器吸取消炎痛-EDTA-Na2液约0.1 ml，快速心脏穿刺取血5 ml，混匀，注入试管中，4℃ 3 500 r/min离心15 min，分离血浆，-20 ℃保存，按放免试剂盒方法测定TXB2、6-keto-PGF1α。再将豚鼠处死，取右肺叶组织10％福尔马林中固定，常规石蜡包埋，供病理组织切片，HE染色后光镜下进行组织学观察。
       
       豚鼠致敏后以卵蛋白雾化吸入，可诱发急性气道过敏反应，包括速发相哮喘反应和迟发相哮喘反应，这种模型较类似于人类哮喘。由于Ⅰ级哮喘反应（仅呼吸困难）不易于观察，而发生Ⅲ级反应（呼吸困难、咳嗽、休克跌倒）会造成豚鼠死亡率较大，故记录豚鼠发生Ⅱ级哮喘反应的潜伏期作为评价指标。模型组豚鼠约在吸入卵蛋白后2 min发生哮喘反应，低剂量FCM与模型组相比没有显著差异，FCM 150 mg/kg能显著延长Ⅱ级哮喘潜伏期。结果见表3。
       
       反复喷雾卵蛋白诱发哮喘后，产生哮喘迟发相反应，模型组豚鼠血浆中6-keto-PGF1α含量较对照组明显减少（P<0.01），TXB2含量较对照组明显增高（P<0.05），但给药各组未统计出显著性差异（P>0.05）。哮喘的迟发反应会引起嗜酸性粒细胞(EOS)在肺部的聚集和浸润。我们在正常豚鼠肺组织中并未发现EOS，而模型组豚鼠肺组织有大量EOS聚集，经FCM治疗后，75 mg/kg剂量组EOS明显减少，150 mg/kg剂量组偶见少许EOS，结果见图1～5，结果提示，FCM有可能是减少了聚集到气道的EOS发挥抗炎作用并缓解哮喘症状。表3  桑白皮黄酮对卵蛋白所致哮喘豚鼠引喘潜伏期的影响（略）
       3  讨论
          
       哮喘是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等) 和细胞组份参与的气道慢性炎症性疾患［6］，在我国其发病率呈逐年上升趋势。近年分离得到一些桑白皮黄酮类物质，具有多种生理活性如：抗病毒［7］、降压［8］、抗HIV等作用，经过实验论证，很有可能在黄酮中也存在具有平喘作用的物质。
       
       嗜酸性粒细胞浸润程度与哮喘患者气道炎症密切相关［9］。本实验中卵蛋白致敏攻击后，隔日喷雾卵蛋白反复诱发哮喘的发生，模拟哮喘患者反复接触变应原使病情逐渐恶化的过程，6日后在肺部组织切片中均发现有大量的嗜酸性粒细胞，而对照组豚鼠肺组织无炎性细胞浸润，FCM治疗组减少嗜酸性粒细胞在肺部的浸润程度，提示药物治疗过程中减少了聚集到气道的EOS，这就相当于降低了EOS处理和递呈特异性抗原的能力，从而减轻了EOS所释放的毒性蛋白对肺组织的损伤以及气道高反应性的形成，因而可能是抗气道炎症的作用发挥平喘作用。
       
       哮喘时，花生四烯酸生成 TXB2/PGI2失衡，引起血管渗出、气管粘膜水肿及平滑肌痉挛［10］。6-keto-PGF1α为 PGI2在体内的代谢产物，通过测定血浆中TXB2、6-keto-PGF1α的浓度变化，可以研究多种因素对哮喘的影响。但实验未统计出显著性差异，有可能药物不是通过这条途径改善哮喘症状的。
       【参考文献】
         　　［1］徐宝林,张文娟, 孙静芸. 桑白皮提取物平喘、利尿作用的研究［J］.中成药,2003,25(9):758.
       
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       ［3］张国刚, 黎琼红, 叶英子博, 等. 桑白皮黄酮化学成分的研究［J］. 中国药物化学杂志,2005,15(2):108.
       
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       ［9］Trautmann A, Schmid-Grendelmeier P, Kruger K, et a1. T cells and eosinophils cooperate in the induction of bronchial epithelial cell apoptosis in asthma［J］. J Allergy Clin Immunol,2002,109(2):329.
       
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