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       【摘要】 
       目的观察泰山四叶参多糖（PCL）对幼年小鼠和免疫抑制小鼠的免疫调节作用。方法将小鼠随机分为生理盐水对照组、环磷酰胺（CTX）对照组、PCL组（200 mg·kg-1·d-1）和CTX与PCL高、中、低剂量（100，200 ，400 mg·kg-1·d-1）联用组，连续ig 14 d，检测胸腺和脾脏指数、巨噬细胞吞噬功能以及血清特异性抗绵羊红细胞（SRBC）抗体IgM，IgG水平；并检测0.5～16.0 mg·ml-1等比设计的6个PCL浓度对体外培养的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果PCL能显著提高幼年小鼠胸腺指数和脾脏指数、巨噬细胞对鸡红细胞（CRBC）的吞噬率和吞噬指数，提高血清抗SRBC抗体水平，促进脾淋巴细胞在体外的增殖能力；呈剂量依赖性地拮抗CTX对小鼠的免疫抑制作用。结论PCL对幼年小鼠和免疫抑制小鼠的非特异性和特异性免疫功能均有明显的增强作用。
       【关键词】  泰山四叶参； 多糖； 环磷酰胺； 免疫调节
       Immunoregulation of Polysaccharides from Radix Codonopsis Lanceolatae from Mount Taishan in Juvenile and Immunosuppressed Mice
       WANG Decai, QIU Yuyu, ZHANG Xianzhong, GAO Lijun
       （Department of Biological Science, Taishan Medical College, Taian 271016, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the immunoregulation of polysaccharides extracted from Radix Codonopsis Lanceolatae from Mount Taishan(PCL) in juvenile and immunosuppressed mice. MethodsThe juvenile mice were divided randomly into six groups,namely, normal saline control, cyclophosphamide(CTX)control, PCL(200mg·kg-1·d-1）group,and three combination groups(CTX and 100，200 ，400mg·kg-1·d-1 PCL). After given orally for two weeks, the thymus and spleen index, the celiac macrophage ability of engulfing CRBC, and the antibody level of serum against SRBC were determined. Effects of six concentration levels of PCL on spleen lymphocyte proliferation were observed.  ResultsCompared with the control group, in juvenile mice, PCL could increase the thymus and spleen index, enhance the phagocytic ability of the macrophage, increase the antibody level, and promote the spleen lymphocyte proliferation. In immunosuppressed mice induced by CTX, PCL could  improve the immunologic indexes, counteract the immunosuppression of CTX with dose-dependence. ConclusionPCL can enhance non-specific and specific immunity of both of the juvenile mice and the immunosuppressed mice.
       Key words：Radix Condonopsis Lanceolatae from Mount Taishan;   Polysaccharides;   Cyclophosphamide;   Immunoregulation
       
       四叶参Codonopsis lanceolata Benth.et Hook.F.又名轮叶党参、羊乳、山胡萝卜等，系桔梗科党参属多年生草质缠绕藤本植物，在我国主要分布于东北、西南等地区。四叶参在泰山山系也有分布，根入药，具清热解毒、止咳祛痰、补虚通乳、健身补气等功效，用于肺痈咳嗽、病后虚弱、产后缺乳等症，系泰山四大名药之一［1］。前期研究结果表明，泰山四叶参提取物具有耐缺氧、抗疲劳、抗氧化等作用［2～4］。为探讨四叶参提取物中活性成分的作用，本实验从泰山四叶参中提取分离多糖并观察其对幼年小鼠和环磷酰胺免疫抑制模型小鼠的免疫调节作用。
       1  材料与仪器
       1.1  药材来源及多糖制备
       四叶参采自泰山东麓，秋季采挖，洗净，切片，50℃烘干，粉碎成粗粉备用。经本院生药学教研室周红英教授鉴定为四叶参Radix codonopsis lanceolatae的干燥根。参考文献方法［5，6］，取泰山四叶参粗粉500 g，加4倍量石油醚回流脱脂两次，2 h/次；滤渣加4倍量80％乙醇回流提取两次，2 h/次。经脱脂、醇提后的滤渣在60℃烘干，分别加6倍量、5倍量、4倍量蒸馏水在95℃水浴中浸提3次，2 h/次，合并滤液，减压浓缩至1 000 ml。浓缩液加200 ml，氯仿正丁醇（4∶1）液，剧烈振荡30 min，以4 000 r·min-1离心15 min，去除下层氯仿及中层变性蛋白，取上部水层再重复除蛋白操作，至无明显中层为止。收集去蛋白后的上部水层，加无水乙醇至溶液含醇量达80％，4℃冰箱中静止过夜，以4 000 r·min-1离心15 min，收集沉淀物，再依次用95％乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤各两次，得多糖粗品。再以水－乙醇重沉纯化两次，60℃烘干，得白色粉末状四叶参多糖（polysaccharide from Codonopsis Lanceolata，PCL  ）提取物28.6 g，得率5.7％。以葡萄糖为对照品，用苯酚-硫酸法测得提取物中总糖含量为93.8％。实验前用生理盐水配制成浓度为0.5％，1％，2％的多糖溶液。小鼠脾淋巴细胞增殖实验中，多糖溶液用RPMI-1640培养液稀释至1，2，4，8，16，32 μg·ml-1，0.22 μm滤膜除菌备用。
       1.2 药品与试剂
       RPMI-1640(PEPPBIO公司)；小牛血清（NBS，BBI公司）；刀豆蛋白（ConA，Sigma公司，用RPMI-1640培养液配制10 μg·ml-1，0.22 μm滤膜除菌备用）；四甲基偶氮唑盐（MTT，BBI公司，用PBS溶解为5 μg·ml-1，滤过除菌备用）；羊抗小鼠IgG(Solarbio公司)；注射用环磷酰胺（CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司）； 0.9％氯化钠注射液（NS，山东华信制药有限公司）；青霉素、链霉素（山东鲁抗医药股份有限公司）；营养肉汤粉（青岛海博生物技术有限公司）；十二烷基磺酸钠（SDS，上海山浦化工有限公司）；二甲基甲酰胺（DMF，北京鼎国生物技术有限公司）。补体、2％鸡红细胞、5％和20％绵羊红细胞（SRBC）自制。其它试剂均为国产分析纯。
       1.3 仪器
       RE-5205旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；GL-20G-Ⅱ冷冻离心机、LD-6离心机（上海安亨科学仪器厂）；AIR TECH超净工作台（苏净集团安泰公司）；MLS-2420高压自动灭菌器(日本)；Olympus BX60显微镜（日本）；CO2培养箱LAB-LINE（日本）；MK-3酶标仪（热电（上海）仪器有限公司）；752紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。
       1.4  动物清洁
       级昆明种小鼠，雌雄各半，3周龄，体重（14±2）g，山东省生物制品研究所提供，合格证：鲁动质字20030011。
       2  方法
       2.1  PCL对小鼠巨噬细胞吞噬活性和免疫器官指数的影响
       2.1.1   实验分组和给药  采用均衡随机区组设计，将90只小鼠随机分为6组，每组15只,即NS组（20 ml·kg-1·d-1，正常对照组）、CTX组（CTX＋NS，免疫抑制模型对照组）、PCL组（200 mg·kg-1·d-1）、CTX＋PCL低剂量组（100 mg·kg-1·d-1）、CTX + PCL中剂量组（200 mg·kg-1·d-1）、CTX + PCL高剂量组（400 mg·kg-1·d-1）。各组小鼠每天等容积（20 ml·kg-1）灌胃给药1次，连续给药14d, 并在给药的第4，7，10，13天时给小鼠称重，调整给药剂量。使用CTX的4个组在第4，7，10，13天时在小鼠前肢腋窝皮下注射用无菌生理盐水配制的CTX 25mg·kg-1。
       2.1.2    对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响  在实验结束的前3 d各组小鼠均给予腹腔注射1％淀粉肉汤50 ml·kg-1，以诱导巨噬细胞游出。末次给药24 h后腹腔注射2％鸡红细胞悬液50 ml·kg-1，轻柔腹部使鸡血球分散。0.5 h后处死小鼠并称重，打开腹腔，用洁净小吸管吸取腹腔液约0.2 ml涂在玻片上，待玻片自然干燥后，瑞氏染色，油镜观察。顺序计数100个巨噬细胞，分别记录有吞噬作用和没有吞噬作用的细胞数，对有吞噬作用的巨噬细胞同时记录吞噬的鸡红细胞数，每只小鼠同时制作3张玻片，取平均值。以吞噬率和吞噬指数作为评价巨噬细胞吞噬活性的指标［7］。
        
       吞噬率(%)＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞×100％
        
       吞噬指数＝100个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数/100
       2.1.3 对小鼠免疫器官指数的影响     
       将制片后的小鼠剖取胸腺和脾脏并称重。以胸腺或脾脏重量（mg）与体重（g）之比作为胸腺和脾脏指数［7］。
       2.2 PCL对小鼠血清抗SRBC抗体水平的影响
       另取小鼠90只，实验分组以及给药方法、剂量、时间等同“2.1.1”项。在给药的第3天和第8天各组小鼠均腹腔注射20％SRBC 0.2 ml，以免疫小鼠产生特异性抗SRBC抗体。末次给药24 h后（第2次免疫后的第7天），小鼠摘眼球取血，4℃冰箱过夜，分离血清。依照文献方法［8］将每一只小鼠的血清分成两份：一份不作处理，一份加等量0.2 mol·L-1的2－巯基乙醇后，37℃水浴保温0.5 h；两份血清均用NS稀释500倍。取稀释后的2－巯基乙醇处理血清0.5 ml加5％SRBC 0.5 ml混匀，再加羊抗小鼠IgG和补体各0.5 ml；取稀释后的未处理血清0.5 ml依次加5％SRBC、补体、NS各0.5 ml；空白管以NS代替血清，混匀。置37℃温箱温育1 h后，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液在540 nm处测定吸光度（A540）值。血清溶血素即抗SRBC抗体含量（HC）按下式计算：
        
       HCIgG＝2－巯基乙醇处理血清的A540 ×500      HCIgM＝未处理血清的A540 ×500
        
       HCIg＝HCIgG＋HCIgM
       2.3  PCL对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
       常规无菌制备幼年小鼠脾细胞悬液，用RPMI-1640不完全培养液洗涤两次，1 000 r·min-1离心10 min。用含10％NBS的RPMI-1640完全培养液调整细胞数为5×106 ·ml-1，台盼蓝染色并镜检，细胞存活率>95％。
        
       将96孔细胞培养板中央孔区分为8组，每组6孔。每孔加入脾细胞悬液100 μl，6个实验组分别加入不同浓度的PCL溶液100 μl，PCL终浓度分别为0.5，1，2，4，8，16 μg·ml-1；阳性对照组加10 μg·ml-1的ConA 100 μl(终浓度为5 μg·ml-1)；空白对照组加入RPMI-1640完全培养液100 μl。置37℃，5％CO2培养箱中培养68 h后，每孔加入5 mg·ml-1的MTT溶液10 μl，再继续培养4 h后，取出培养板，每孔加入20％SDS-50%DMF pH2.0的甲臢溶解剂100 μl，于振荡器上振荡30 s，静止20 min后，在570 nm处用全自动酶标仪进行比色分析。
       2.4 数据处理
       数据均以±s，采用SPSS12.0统计软件进行数据分析，方差分析或t检验分析组间差异。
       3  结果
       3.1  PCL对小鼠免疫器官指数及巨噬细胞吞噬活性的影响
       结果见表1。CTX组小鼠胸腺、脾脏萎缩，指数下降，PCL组小鼠胸腺、脾脏指数均见升高，并能剂量依赖性地拮抗CTX引起的小鼠胸腺和脾脏指数的下降。表1  PCL对小鼠免疫器官指数及巨噬细胞吞噬能力的影响（略）
       
       PCL可明显增强正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，与NS对照组比较，吞噬率和吞噬指数均显著提高（P<0.01），并能剂量依赖性地拮抗CTX引起的小鼠巨噬细胞吞噬活性的下降，中剂量（200 mg·kg-1·d-1）的PCL可使CTX处理的小鼠巨噬细胞吞噬活性恢复正常。
       3.2  PCL对小鼠血清抗SRBC抗体水平的影响
       与NS对照组比较，CTX组小鼠血清特异性抗SRBC抗体IgM、IgG水平显著降低，PCL组小鼠抗体水平则明显增高。3个CTX与PCL联合组，随PCL剂量的增加，IgM、IgG以及抗SRBC总抗体水平逐渐提高，对CTX的拮抗效应逐渐增强，呈良好的良效关系。结果见表2。
       3.3  PCL对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
       脾淋巴细胞的增殖能力用吸光度（A570）表示。由表3可知，在体外各浓度的PCL均能显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，以4μg·ml-1浓度组的吸光度最高，但仍显著低于ConA组（P<0.01）。表2  PCL对小鼠血清溶血素水平的影响（略）表3  PCL对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（略）
       4  讨论
           
       资料显示，幼年小鼠的免疫系统对免疫药物敏感性较成年鼠高［7］，故选用未成年的幼鼠进行本项研究。本实验结果显示，PCL能增加正常幼年小鼠胸腺、脾脏指数，增强腹腔巨噬细胞吞噬活性，提高特异性抗SRBC抗体水平，促进脾淋巴细胞增殖，提示PCL可影响正常幼年小鼠的非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫功能等，能提高机体免疫力，有较好的免疫功能增强作用。
        
       CTX是经典免疫抑制剂之一，本实验显示CTX能引起小鼠免疫器官显著萎缩，巨噬细胞吞噬活性和特异性抗SRBC抗体水平明显降低，表明本实验中CTX免疫抑制小鼠模型是成功的。3个CTX与PCL联合组，PCL呈剂量依赖性地拮抗CTX免疫抑制作用，提示PCL能显著提高免疫抑制小鼠的免疫功能。
        
       四叶参含有多种有效成分，多糖类是其主要有效成分之一［9］；泰山四叶参中多糖含量高达10％以上［10］。本实验结果提示PCL在抗肿瘤、抗病毒及免疫调节等方面可能有重要作用和良好的应用前景。泰山四叶参资源丰富、多糖含量高，值得进一步研究。另外，本实验在多糖提取分离过程中尽管包括去除杂蛋白、单糖、寡糖及其他小分子物质等步骤，但所得PCL仍是一类高分子多糖的混合物。PCL的分级纯化以及各种组分理化性质和生物学活性的差异还有待于进一步研究。
       【参考文献】
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       ［3］王德才，李同德，徐晓燕，等. 泰山四叶参提取物对小鼠抗氧化能力的影响［J］. 中国中医药信息杂志，2008，15（1）：37.
       
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       ［6］李发胜，杨 光，咸 丰，等. 漏芦多糖对小鼠激发态免疫功能的影响及其可能机制［J］. 中国中药杂志，2007，32（5）：433.
       
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       ［8］徐叔云，卞如濂，陈 修. 药理实验方法学［M］. 北京：人民卫生出版社，1991：1215.
       
       ［9］付成国，文连奎，董 然. 轮叶党参化学成分与药理研究进展［J］. 中药材，2007，30（4）：497.
       
       ［10］王德才，李同德，高丽君. 泰山四叶参多糖的提取及含量测定［J］. 时珍国医国药，2008，19（10）：2434.